一株鸡源芽孢杆菌的分离鉴定和益生性研究*

孙昊岩，蒋立文，李珊珊，孙孟新，褚秀玲，苏建青

（聊城大学农学院，山东 聊城 252000）

随着食品安全监管的加强和抗生素饲料添加剂的禁用。肉鸡消化道保健的抗生素替代品成为集约化养禽业的研究热点，中药草、益生菌和生物制剂都具有广阔的应用前景。微生态制剂作为一种自然、环保的生物制剂，具有较高的开发和应用价值[1]。其中芽孢杆菌因为对酸、高温、胆盐和抗菌素等具有很强的抵抗力，是理想的微生态制剂研发菌，在1996年就被写入饲料添加剂目录。试验研究和临床应用显示芽孢杆菌进入家禽消化道以后，能很快开始繁殖，消耗消化道内的氧气，产生消化酶、抗菌肽和维生素等有益物质，提高消化道的免疫力。芽孢杆菌可以产生多种有益消化的酶如淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶等，促进饲料的消化和降解，提高饲料生物利用率。芽孢杆菌可以通过非核糖体肽途径合成脂肽化合物和聚酮化合物，抑制细菌、病毒和真菌的繁殖，拮抗病原菌的生长，有效预防消化道疾病[2]。菌种的安全性和益生特性是关系到芽孢杆菌保健功能的重要基础。来自于本体动物的菌种具有更高的安全性，为了分离到鸡源芽孢杆菌作为益生菌，试验从肉鸡消化道中分出芽孢杆菌，并对其理化特征和益生性进行研究，为临床筛选高效、安全和绿色的微生态菌种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试剂和设备 营养琼脂、酵母粉、蛋白胨购自安徽博美；细菌微量生化鉴定管和药敏纸片购自杭州滨河微生物研究所；革兰氏碘染液、淀粉、氯化钠、可溶性淀粉、猪胆盐等购自阿拉丁。设备包括高压蒸汽灭菌锅、雷氏pH计、苏州超净工作台、恒温水浴锅、台式高速离心机、奥林巴斯光学显微镜，恒温水浴摇床等。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌的分离 采用稀释涂布平板法分离[3]，取健康肉鸡盲肠粪便5g，置入100ml的离心管中，加生理盐水30ml，震荡混匀，纱布过滤。将滤液放入50ml的玻璃离心管中，在80℃水浴中加热10min，取出后在室温静置10min，等温度下降后，用一次性无菌吸管取适量液体，加到营养琼脂平板上，用涂布器涂匀，静置30min后，倒置放入37℃培养箱中培养。24h后观察有无菌落出现。

1.2.2 芽孢杆菌的纯化 挑取平板上形态较好的单个克隆菌落在LB营养琼脂上进行划线培养，重复划接种培养3次，最后，得到纯的菌株。将纯化的单一菌株进行扩增培养，选取菌落形态典型的单个菌落加入5ml的LB培养基中，37℃，150r/min恒温水浴摇床培养16h，并在培养后加入甘油-80℃冻存，用于下面的鉴定和性能研究。

1.2.3 芽孢杆菌的形态鉴定 取一滴纯培养的菌液，用适量的甘油盐水稀释后涂片，革兰氏染色，通过光学显微镜观察细菌形态和大小。染色方法见说明书。

1.2.4 芽孢杆菌的生化鉴定 生化试验按照试剂盒说明操作，对分离到的细菌进行VP、甲基红（MR）、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、硝酸盐还原试验、产H2S试验、吲哚试验、明胶液化试验和糖酵解等试验。参照伯杰细菌鉴定手册[4]及常见细菌系统鉴定手册[5]鉴别。

1.2.5 芽孢杆菌益生性研究

1.2.5.1 细菌计数试验 将LB培养出来的细菌采用有限稀释法进行计数。既吸取100μl菌液，加入900μl的LB培养基中，混匀，然后再吸取稀释后的 100μl菌液，加入 900μl的 LB培养基中，混匀，以此类推。每个稀释度吸取100μl菌液涂板计数，重复三次。计数细菌的含量。

1.2.5.2 耐高温试验 取5ml菌液，分别加入15个20ml的离心管中，每3个离心管一组，分别放到 60、70、80、90℃和 100℃的水浴中 10min， 然后取出来冷却到室温，采用平板稀释法计数，以原菌液作为对照，观察温度对芽孢杆菌存活率的影响。菌种存活率 (%)=［1－(对照组含菌量－不同条件处理后含菌量)/对照组含菌量］×100%。

1.2.5.3 耐酸试验 取20ml菌液，分别加入4个50ml的小烧杯中，用0.1mol/L HCl分别将pH值调成 2.0、3.0、4.0、5.0，每个 pH 值的菌液取 5ml分装到10ml的离心管中，每个pH值3个。放到37℃的摇床中培养2h，然后取出来采用平板稀释法计算细菌的存活率。计算方法同上。

1.2.5.4 耐胆盐试验 配置0.5%、0.4%、0.3%和0.2%猪胆盐含量的LB培养基，分别取以上浓度的猪胆盐培养基2.5ml到10ml的离心管中，每个管中分别加入2.5ml的细菌LB培养液，混匀，每个浓度重复3个，放到37℃的摇床中培养2h，然后取出来采用平板稀释法计算细菌的存活率。计算方法同上。

1.2.5.5 抗致病菌活性测定 抗致病菌测定采用牛津杯法，致病菌使用实验室保存的大肠杆菌和沙门氏菌。取150μl的大肠杆菌和沙门氏菌分别加到两个LB平板上，用涂布器涂匀，将6个牛津杯均匀插到琼脂里，每个牛津杯中加入芽孢杆菌菌液 200μl，置 37℃的培养箱中，培养 24h，测定抑菌圈的直径。

1.2.5.6 产淀粉酶活力测定 采用平板透明圈法[6]，在溶解的100ml LB营养琼脂中加入1g可溶性淀粉，121℃高压灭菌15min，冷却后倒板。将直径6mm的空白药敏纸片放到芽孢杆菌培养液中浸泡5min，然后贴到培养基上，每个平皿贴4片。放到 37℃的培养箱中，培养24h，取出培养皿，用吸管将革兰氏染液加到平皿表面，恰好覆盖就行。染色5min后，倾去染液，观察贴纸片处的空白环直径。求取平均值。

1.2.6 药敏试验 采用K-B纸片扩散法[7]，根据抑菌圈的大小判断分离菌对抗生素的敏感性。将分离菌接种到液体LB培养基中，37℃摇床过夜。对培养后的细菌进行计数，并将细菌稀释到1.0×108CFU/ml，吸取100μl稀释后的菌液，加到营养琼脂平板中，涂布器涂匀，静置5min后，用镊子将药敏纸片贴于培养基表面，37℃培养过夜，用游标卡尺测量抑菌环直径。每种抗生素重复3次，计算平均值。抑菌环的大小根据《抗微生物药物敏感性试验规范》判断细菌对药物的敏感性效果。结果判定标准：抑菌圈直径小于10mm不敏感，直径在10～15mm之间中度敏感，直径大于15mm敏感。

1.2.7 数据处理 数据处理用Excel统计分析数据，试验结果用平均数±标准差表示。

2 结果

2.1 芽孢杆菌分离和纯化 在营养琼脂上分离到多株分离菌，然后通过连续划线分离，分离到多个纯化的菌落。通过初步的筛选，如菌落生长快速、形态特征好和生化性能符合要求等，选出一株优秀的菌株。挑取筛选出的菌株进行扩增培养，用体积分数为30%的甘油对其进行保藏，备用，进行进一步的研究。

2.2 芽孢杆菌的形态特征 分离菌在营养琼脂上生长快速，菌落色暗，不透明，呈乳白色，形态不规则，表面有褶皱并向外扩散（图1）。菌落涂片革兰氏染色显示，分离菌呈紫色杆状，是革兰氏阳性细菌（图2）。分离菌在试管LB中生长，管底呈白色絮状物，液面产生白色的菌膜。

图1 芽孢杆菌菌落特征图

图2 芽孢杆菌革兰氏染色阳性

2.3 芽孢杆菌的生化特征 对分离菌进行生化鉴定，试验结果见表1。根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，分离菌的染色特性、生化试验和菌落形态特征，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

表1 菌株的生化特征

2.4 芽孢杆菌益生性研究

2.4.1 耐高温试验 分离菌在 60、70、80、90℃和100℃的水浴中10min后，进行计数，发现分离菌有一定的耐高温作用，在80℃之前有较高的存活率，80℃的存活率是 （84±3.6）%， 但到了 90℃和100℃后，下降较快，100℃的存活率是（8±4.6）%，见图3。

图3 芽孢杆菌耐高温试验图

2.4.2 耐酸试验 分离菌在pH值调成2.0、3.0、4.0和5.0的培养基中生长2h后，进行计数，结果发现，随着pH值的下降，分离菌的存活率也下降，见图4，但是到pH2.0时，存活率还能达到（84±5.2）%。

图4 芽孢杆菌耐酸试验

2.4.3 耐胆汁试验 分离菌接种到含0.5%、0.4%、0.3%和0.2%猪胆盐的LB培养基中培养2h后，进行计数，结果显示，随着猪胆汁的浓度升高，分离菌的幸存率发生下降，但是，即使是浓度最高的0.5%的猪胆汁培养基，分离菌的幸存率还能达到（84±5.2）%。 见图 5。

图5 芽孢杆菌耐胆盐试验

2.4.4 抗致病菌活性测定 使用牛津杯法测定芽孢杆菌的抗致病菌试验，结果显示芽孢杆菌能够抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长，对大肠杆菌的抑菌圈直径为14.16±1.4mm，对沙门氏菌的抑菌圈直径为11.58±2.3mm，说明分离菌具有一定的抑制病原菌的作用，大肠杆菌的效果略优于沙门氏菌。

2.4.5 产淀粉酶活力测定 采用平板透明圈法测定分离菌的产淀粉酶活力测定，试验结果显示，浸泡过芽孢杆菌的滤纸周围染色后出现透明圈，说明分离菌能够产生淀粉酶，透明圈的直径为13.58±1.4mm，说明分离菌具有产生淀粉酶的能力。

2.5 药敏试验结果 采用K-B纸片扩散法，测定分离菌对12种常用抗菌素的药敏试验，根据药敏试验获得的药敏环直径大小判定分离菌对抗生素的敏感性，结果显示，分离菌对土霉素和金霉素耐药，对青霉素、链霉素、杆菌肽、丁胺卡那霉素和头孢唑啉中度敏感，对庆大霉素、多粘菌素B、强力霉素、链霉素和红霉素敏感。说明分离菌对试验用抗生素大部分敏感，仅对少数抗生素耐药。具体结果见表2。

3 讨论

随着食品安全和环境保护的监控和要求越来越严格，抗生素饲料添加剂逐步退出市场。微生态制剂具有绿色、环保和生态的优点。芽孢杆菌因为具有芽孢，能够耐高温、耐酸和方便保存，已经被我国农业部批准为微生态饲料添加剂。一种好的微生态饲料添加剂必须从菌种抓起。要求菌种安全、有效和稳定。而不同种属来源的芽孢杆菌对宿主作用差异较大，因此，来源于本体动物的菌种最有优势[8]。因此，我们从肉鸡的盲肠中分离到多株芽孢杆菌，并对其中一株在形态和生化鉴定比较典型的枯草芽孢杆菌进行益生性研究，评价其作为微生态菌种的潜在价值。

表2 菌株药敏试验结果

形态鉴定和生化试验鉴定显示分离的菌种符合枯草芽孢杆菌的特性。通过对其抗酸、抗盐和耐高温试验研究，结果显示分离菌在80℃以下、pH值2.0以上和胆盐浓度0.3%以下存活率均能达到80%以上，符合饲料工艺和肉鸡胃肠道的生理环境。对有害菌的抑制试验也显示，分离菌可以抑制大肠杆菌和沙门氏菌，并能产生一定的淀粉酶，可以起到对肉鸡肠道的保健作用。分离菌药敏试验结果显示，分离菌对大部分常见的抗生素敏感，但是对土霉素和金霉素耐药，可能是肉鸡饲料中长期添加土霉素或金霉素，导致分离菌耐药。试验结果也显示分离菌对大部分抗生素中度敏感，而少数抗生素敏感，说明抗生素的大量使用造成分离菌的耐药性问题很严重。作为益生菌的菌种要求对抗生素敏感，本试验分离的益生菌基本符合要求。

试验初步获得了来源于肉鸡肠道的一株枯草芽孢杆菌，菌种具有一定的益生功能，需要进一步的诱导和筛选，并通过动物实验来确定菌种的价值。

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