进水pH值对CASS工艺处理低浓度生活污水中氧化亚氮排放的影响

毛念佳，嵇鸿民，许 柯，任洪强，李颖瑜

（南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，江苏南京 210046）

氧化亚氮（N2O）是大气中含量仅次于CO2和CH4的温室气体，其在污水生物处理过程中的排放日益受到关注［1］。美国环保署报告称，污水处理过程中释放的N2O占总释放量的3%［2］。IPCC报告中指出，污水处理厂污水处理过程中大约0.05%～25%的氮被转化成N2O形式释放，约占全球N2O总排放量的1.2%［3］。因此，深入了解污水处理过程中N2O的产生机理和减量控制具有重要意义。

周期循环活性污泥法（cyclic activated sludge system，CASS）是基于SBR工艺的一种新型污水处理技术，因其系统组成简单、操作运行灵活多变、基建费用低和可靠性好等特点，在国内外得到了广泛的应用［4-5］，当前关于污水生物脱氮过程中N2O释放特征的研究主要以SBR、AAO、氧化沟等工艺为主［6-7］，而对于CASS工艺脱氮过程中N2O的排放及机理研究较少。

pH作为CASS工艺运行中的实时控制参数，对微生物的代谢活动具有重要影响，同时对生物脱氮过程中某些物质（如游离氨、HNO2等）的存在及浓度产生影响，是控制生物脱氮过程正常进行和影响N2O产生量的重要条件。本研究考察了进水pH对CASS工艺过程中N2O排放的影响，并从微生物群落结构、功能基因层面分析N2O产生机理，旨在为实际工艺运行中N2O的减排提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验装置与运行条件

试验所用CASS反应器由有机玻璃制成，如图1所示。反应器长43 cm、宽11 cm、高15 cm，水面超高5 cm，有效容积为4.66 L。生物选择区、缺氧区和主反应区容积分别为0.25、0.33 L和4.08 L。模拟污水经由蠕动泵进入反应器，通过电磁阀控制出水。

图1 CASS反应器示意图Fig.1 Schematic Diagram of CASS Reactor

本试验采用间歇进水，一个周期包括了进水、曝气、沉淀、排水这四个阶段，运行时间分别为0.8、2、1、1 h，共4.8 h。装置由电子计时器控制开关，可实现周期式自动连续运行。每周期进水1.86 L，出水后剩余体积2.80 L，排水比40%。接种污泥取自南京江心洲污水处理厂，污泥浓度在3 000 mg／L左右；反应器末端设有污泥回流管，污泥经回流泵进入生物选择区，污泥回流率为20%。

1.2 模拟污水

本试验采用模拟污水，组分为：一水合葡萄糖，51 mg／L；蛋白胨，100 mg／L；氯化铵，80 mg／L；磷酸二氢钾，13 mg／L；七水合硫酸镁，25 mg／L；二水合氯化钙，11 mg／L；微量元素浓缩液，0.6 mL ／L。微量元素浓缩液组分为：FeCl3·6H2O，1.50 mg／L；KI，0.18 mg／L；ZnSO4· 7H2O， 0.12 mg／L；H3BO3，0.15 mg／L；MnCl2· 4H2O，0.12 mg／L；CoCl2·6H2O，0.15 mg／L；CuSO4· 5H2O， 0.03 mg／L；Na2MoO4·2H2O，0.06 mg／L；EDTA，10 mg／L。主要营养物质浓度为：COD150mg／L，NH＋4_N 21 mg／L，

TN 36 mg／L，TP 3 mg／L，五个反应器进水 pH 值分别调节为 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0。

1.3 分析方法

1.4 实时荧光定量PCR分析

试验采用SYBR Green染料法，对污泥中反硝化功能基因nirS（编码的血红素cd1型亚硝酸还原酶）、nirK（编码铜型亚硝酸还原酶）、nosZ（N2O还原酶催化中心）进行定量分析［9］。以大肠杆菌感受态细胞制备质粒标准品，建立标准曲线（R2＞0.999），扩增程序实时荧光定量 PCR仪 AB7500（Life Technologies，美国）进行，热循环过程为：95℃ 3 min，40个循环的95℃ 20 s，退火 30 s，72℃延伸 40 s。反应体 系为 25 μL，含 12.5 μL 2 ×SYBR®Green PCR Master Mix（Vazyme，中国），2 μL模板 DNA （20 ng／μL），正反向引物各 0.5 μL（20 μmol／L），9.5 μL 无菌超纯水，每个样品做三个平行样。以标准品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，做标准曲线，对待测功能基因或细菌定量，计算其拷贝数，如表1所示。

表1 目标基因的引物序列及退火温度Tab.1 Primer Sequences for Target Genes and Corresponding Annealing Temperature

1.5 16S rRNA高通量测序

以FastDNA Spin Kit for soil试剂盒提取污泥DNA，稀释至20 ng／μL后用于16S rRNA基因V1-V2区域PCR扩增，每个样品做四个平行样。PCR扩增 中 用 到 的 正 向 引 物 序 列 （5′-3′）为AGAGTTTGATYMTGGCTCAG，反向引物序列（5′-3′）为 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCR。扩增体系为50 μL，包含 2 × EasyTaq©PCR SuperMix 25 μL，正向和 反 向 引 物 （10 μmol／L）各 1 μL，DNA 模 板2 μL，超纯水21 μL。PCR 扩增过程为：首先 98℃预热5 min，再经过扩增程序，其中98℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，此扩增程序循环20次，最终72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。然后将平行样合并，用E.Z.N.A.TM Cycle-Pure试剂盒（Omega Bio-tek Inc.，USA）对扩增产物纯化，再用超微量分光光度仪测定纯化样品浓度和纯度。

纯化产物送至江苏中宜金大分析检测公司进行Miseq高通量测序，所得的结果通过 Sickle软件，Mothur软件对样品数据进行降噪处理，获得序列结果，进行多样本深度归一化处理后，通过R语言程序（R version 3.1.1）绘制热图。

2 结果与讨论

2.1 不同进水pH条件下氮的转化过程

本研究考察了稳定运行20 d（2倍污泥龄）后，各反应器在不同进水pH下一周期内浓度变化，结果如图2所示。由图 2可知，进水 pH 值为 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0时去除率分别为39.5%、65.1%、82.4%、98.0%、99.7%，TN去除率分别为 37.5%、37.1%、40.3%、42.6%、45.7%。随着进水pH的增加，和TN去除率都上升，pH对去除效果影响更大。当进水pH值高于8.4时，N可基本完全去除。为保证较好的脱氮效果，CASS工艺进水pH值最好维持在7.8以上。

由于硝化反应的进行消耗碱度，pH的提高会促进好氧段硝化反应的进行。进水pH值为9.0时，曝气90 min后几乎所有被完全氧化。当进水pH值从6.6增加到9.0时，更多的被硝化菌氧化为最大浓度从9.66 mg／L 增加到 19.70 mg／L。浓度的增多也提高了活性污泥沉淀时缺氧反硝化速率。因此，TN去除率也随进水pH的提高而有所增加。

2.2 不同进水pH条件下N2O的释放特征

本研究考察了不同进水pH下CASS反应器曝气阶段N2O排放速率及一周期溶解性N2O浓度变化，结果如图3所示。进水pH值为6.6～8.4时，N2O排放速率在曝气开始时出现峰值（0.03～0.09 mg N／min），随后逐渐降低，并保持在较低水平（约0.01 mg N／min）。而当进水pH值增加到9.0时，曝气开始时N2O排放速率仅为0.01 mg N／min，在曝气过程中稍有上升，曝气30 min后N2O排放速率（0.02 mg N／min）高于其他反应器。进水pH值为9.0的反应器溶解性N2O浓度在整个周期都低于0.1 mg／L。

不同进水pH下CASS反应器N2O的释放量、转化率及在沉淀出水阶段的产生量如图4所示。随着进水pH值从6.6提高到9.0，每周期N2O排放量从0.32 mg N／L增加到0.52 mg N／L。不同进水pH下N2O转化率差别较小，为6.02%～7.92%，进水pH值为6.6时N2O转化率最低，而进水pH值为9.0时最高。沉淀出水阶段的N2O产生量在pH值为6.6～7.8时随pH的提高从1.28 mg N增加到7.02 mg N，但随着进水pH的继续增加，N2O产生量迅速减少，在进水pH值为9.0时完全没有N2O产生。

图2 不同进水pH值下反应器中污染物浓度变化 （a）6.6；（b）7.2；（c）7.8；（d）8.4；（e）9.0Fig.2 Variation of Pollutant Concentration under Different Influent pH Value（a）6.6；（b）7.2；（c）7.8；（d）8.4；（e）9.0

图3 不同进水pH下曝气阶段N2O排放速率及一周期溶解性N2O浓度变化Fig.3 N2O Emission Rate during Aeration Period and Dissolved N2O Concentration in a Typical Cycle under Different Influent pH Value

图4 不同进水pH下N2O排放特征Fig.4 N2O Emission Characteristics under Different Influent pH Value

当前关于污水处理过程进水pH与N2O排放特征关系的研究不多。Kampschreur等［12］认为与其他影响因素相比，pH的影响较小。然而，本试验中pH对CASS工艺脱氮过程中N2O释放特征的影响不可忽视。pH最高的反应器在硝化过程N2O排放速率高于其他反应器。Law等［13］的研究表明，在富集氨氧化细菌的活性污泥反应器中，随着pH值从6.0增加到8.0，硝化过程N2O产生量逐渐增加，原因与较高的氨氧化速率相关。Hynes等［14］研究Nitrosomonas europeae硝化过程中N2O的产生规律时发现，与pH较低的条件相比，在pH值为8.5的有氧条件下，氨氧化细菌达到最大的NO及N2O产生速率，此时N2O产生的最主要来源是NOH的分解作用。刘越等［15］对短程硝化过程的研究表明，低DO水平下氨氧化速率的提高会引起N2O产生速率的增加，N2O的产生以羟胺氧化途径为主。本试验中NO－2浓度极低，较高的氨氧化速率促进氨氧化菌反硝化途径产生N2O的可能性较小，因此进水pH的提高促进羟胺氧化途径产生N2O。

2.3 反硝化功能基因丰度分析

不同进水pH条件下反硝化功能基因丰度如图5所示。由图5可知，进水pH值为8.4时nosZ和nirS基因丰度最高，分别为 3.54×108copies／mL和3.33×108copies／mL。进水 pH值为9.0的反应器nirK 基因丰度（2.12×107copies／mL）远高于其他反应器（4.91×106～ 6.97×106copies／mL），而 nirS 基因丰度（1.55×108copies／mL）也较高，仅低于进水pH值为8.4的反应器。反硝化菌在高pH条件下数量增加，可能是这两个反应器的TN去除率高于低pH反应器的原因之一。然而，进水pH值为9.0的反应器nosZ基因丰度并非最高，但在沉淀出水阶段却没有N2O产生，可能的原因是pH值为9.0的条件没有促进含有nosZ基因的反硝化菌增长，但增强了N2O还原酶的活性。Shu等［19］研究发现，在进水pH值为4.3～7.8的污水处理厂中，nosZ基因丰度与pH呈负相关关系，与本试验中进水pH值为6.6时nosZ基因丰度高于进水pH值为7.2和7.8的结果接近。

图5 不同进水pH下反硝化功能基因丰度Fig.5 Abundances of Denitrification Functional Genes under Different Influent pH Value

2.4 微生物群落结构分析

本试验利用高通量测序Miseq分析了微生物群落结构，结果如图6所示。pH对变形菌丰度影响较小，不同进水pH条件下的反应器变形菌含量分别为19.23%～23.93%，如图6（a）所示。有研究认为在亚硝化系统中N2O的产生主要来自为Nitrosomonas的反硝化作用［20］。不同进水pH条件下，CASS工艺活性污泥中氨氧化菌（ammoniaoxidizing bacteria，AOB）主要是 Nitrosomonadales，而亚硝酸盐氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）主要是Nitrospira。随着进水pH的增加，氨氧化菌含量在0.43%～0.63%波动，而亚硝酸盐氧化菌含量则从2.58%增加至3.42%。Shu等［21］采用荧光定量PCR测定6个污水处理厂活性污泥硝酸盐氧化菌（Nitrobacter和Nitrospira）的16S rRNA丰度时，发现硝酸盐氧化菌含量也与pH呈正相关关系，与进水COD浓度呈负相关关系，pH对硝酸盐氧化菌细胞增殖起重要作用。

图6 不同进水pH条件下微生物群落结构（a）门水平及变形菌纲分布；（b）反硝化菌相对丰度（＞0.1%）Fig.6 Microbial Community Structure under Different Influent pH Value （a）Distribution in Phylum and Proteobacteria in Class Level；（b）Relative Abundances of Potential Denitrifying Bacteria

不同pH条件下的CASS反应器中反硝化菌相对丰度如图6（b）所示。试验活性污泥样品中共检测到59个反硝化菌属，图6（b）列举了其中相对丰度最高的23个反硝化菌属（相对丰度 ＞0.1%）。由图6（b）可知，进水 pH 值为 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0 的反应器总反硝化菌含量分别为 5.77%、4.16%、4.76%、6.59%、3.89%。优势反硝化菌为 Dechloromonas（1.36%～4.25%）和 Zoogloea（0.75%～1.26%）。不同pH的反应器中Dechloromonas丰度变化较大。在进水pH值为7.2～8.4时，反硝化菌丰度随pH的增加而增加。进水pH值为9.0的反应器反硝化菌丰度最低，因此其在沉淀出水阶段没有N2O累积的原因并不是较多完全反硝化的微生物，而是N2O还原酶在高pH条件下活性更高，反硝化过程N2O还原速率高于产生速率。由于本试验的反应器几乎没有亚硝酸盐产生，即使在进水pH值为6.6的反应器中对应的游离亚硝酸浓度也极低，反硝化菌的生长繁殖没有受到较大的抑制，pH对反硝化菌含量的影响较小。

3 结论

（2）进水pH值为6.6～8.4时，N2O排放在曝气开始出现峰值，随后逐渐降低，并保持较低水平（约0.01 mg N／min）；而进水pH值增加到9.0，曝气开始时N2O排放速率较小，而后在曝气过程中稍有提升。随着进水pH值从6.6提高到9.0，每周期N2O排放量从0.32 mg N／L增加到0.52 mg N／L。

（3）进水pH值为8.4的反应器中nosZ和nirS基因丰度最高，而进水pH值为9.0的反应器nirK基因丰度最高。高pH条件下反硝化菌的数量增加，提高了TN去除率。

（4）不同进水pH下，污泥中氨氧化菌（AOB）主要是Nitrosomonadales，亚硝酸盐氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）主要是Nitrospira。随着进水pH的增加，氨氧化菌含量变化不大，而亚硝酸盐氧化菌含量则从2.58%增加至3.42%。反硝化优势菌种为Dechloromonas（1.36%～4.25%）和 Zoogloea（0.75%～1.26%），Dechloromonas丰度随进水pH变化较大。

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