缺氧对H9C2心肌细胞中miR-19a-3p表达的研究

黄 浩，陈文江，刘长召，王 玲，沈艳芳

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院心血管病中心 445000；2.广东医科大学研究生学院，广东湛江 524023；3.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院健康体检中心 445000)

急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉闭塞，血流中断，造成部分心肌因严重持久性缺血而发生局部坏死，为心内科常见致死性疾病[1-2]。近年来研究发现循环微小 RNA(miRNA) 与心血管系统的生长、发育和心血管系统疾病的发生、发展密切相关[3-6]。有研究报道，循环微小RNA(miR)-19a-3p可能参与AMI、心肌肥厚、肺动脉高压、心房颤动等疾病发生，并可调控心肌细胞分化和维持心脏功能[7-9]。近几年AMI发病机制研究较多，多数认为miR-19a-3p可作为AMI的标志物用于临床诊治[10]。本研究前期结果表明，miR-19a-3p的靶基因可能为低密度脂蛋白受体相关蛋白2(LRP2)；其生物信息功能主要与脂质生物合成过程(lipid biosynthetic process)、脂肪细胞因子信号通路(adipocytokine signaling pathway、interleukin signaling pathway)、缺氧诱导因子介导缺氧反应(hypoxia response via HIF activation)、血管生成(Angiogenesis)、mTOR信号通路(mTOR signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、转化生长因子信号通路(TGF-beta signaling pathway)、化学因子信号通路(chemokine signaling pathway)等有关。心肌缺氧是AMI的主要病理损伤，心肌细胞在不同程度和时间的缺氧条件下可引起心肌细胞氧化应激和炎性反应，导致心肌细胞坏死，从而影响心脏功能[6,11- 12]。本研究拟对不同时间缺氧条件下H9C2心肌细胞中miR-19a-3p的表达进行检测，探讨其具体发病机制，并分析miR-19a-3p与LRP2的相关性。

1 材料与方法

1.1细胞培养 大鼠H9C2心肌细胞株购自上海中科院细胞库，采用低糖DMEM培养基(含 10% FBS和1%的双抗)，培养箱(37 ℃，5% CO2，1% O2)中进行培养，待细胞培养至第6代后，按不同缺氧时间分为7组：缺氧0、4、8、12、16、20、24 h，每组8个60 mm培养皿。达到缺氧时间后立即取出，每组取4个培养皿加入Trizol(美国Invitrogen公司)裂解细胞，按照说明书提取总RNA，―80 ℃保存，以备后续实验。每组的另外4个培养皿加入RIPA细胞裂解液(碧云天公司)，按照说明书提取蛋白，―20 ℃保存，以备后续实验。

1.2miR-19a-3p实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测 培养液miRNA提取采用天根生物有限公司提供的试剂盒进行提取，细胞总RNA按照试剂盒采用Trizol试剂进行提取，然后按照反转录试剂盒(天根生物有限公司)说明书反转录合成 cDNA，荧光定量试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行miR-19a-3p表达水平的检测。荧光定量检测条件：94 ℃变性2 min；聚合酶链反应(PCR)循环中模板94 ℃变性20 s；60 ℃退火、延伸34 s；共30个循环。rno-miR-19a-3p(MIMAT0000789，UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA)及内参U6的引物均为天根生物有限公司提供。本研究采用2-△Ct相对定量方法对数据进行分析：△Ct(实验组)=Ct(实验组目标基因)―Ct(实验组内参基因)；△Ct(对照组)=Ct(对照组目标基因)―Ct(对照组内参基因)。

1.3酶联免疫吸附试验(ELISA) 采用ELISA检测LRP2，采用ELISA试剂盒(DLDEVELOP，DL-LRP2-Hu)，检测范围0.625～40.000 ng/mL，由上海康朗生物科技有限公司提供，按照试剂盒说明书进行相关具体步骤的操作。

1.4LRP2 mRNA的qRT-PCR检测 将所提取细胞的总RNA，按照反转录试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行反转录，qRT-PCR试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行荧光定量：95 ℃预变性30 s；95 ℃扩增，延伸15 s；60 ℃退火30 s，共40个循环，LRP2与内参GAPDH引物均由天根生物有限公司提供。LRP2上游引物：AGC TCT TCT GCT GAT GGA CC，下游引物：TGT ACA CAT TTA GCC ACA GGG C，扩增片段为289 kb，数据分析方法与miRNA实时荧光定量相同。

1.5Western Blot 将提取的不同组间的蛋白质采用BCA法检测蛋白含量后，进行蛋白电泳、转膜、封闭、LRP2 1抗(购自武汉博士德生物有限公司)孵育过夜，次日复温1 h，然后2抗孵育、曝光。LRP2稀释比例为1∶500，选用GAPDH作为内参(稀释比例1∶1 000，购自武汉博士德生物有限公司)，其余相关试剂和材料均购自碧云天生物技术研究所。采用Image J图像分析软件计算蛋白条带灰度值，最后统计结果为目的条带灰度值/内参条带灰度值。

2 结 果

2.1qRT-PCR检测miR-19a-3p 结果比较 分别对缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2细胞培养液中miR-19a-3p进行检测，H9C2细胞培养液中miR-19a-3p表达在缺氧0、4、8、12、16 h差异均无统计学意义(P>0.05)；但缺氧20 h与24 h时，miR-19a-3p表达与缺氧0 h比较，明显升高(P<0.05)；同时对H9C2细胞中miR-19a-3p进行检测，缺氧20 h与24 h时，H9C2细胞中miR-19a-3p的表达与缺氧0 h比较明显下降(P<0.05)。见图1。

2.2ELISA检测培养液中LRP2的结果比较 分别对缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2细胞培养液中LRP2进行检测，发现H9C2细胞培养液中LRP2表达在缺氧16 h后明显升高，缺氧16 h[(675.2±42.40)ng/mL，n=3]、20 h[(979.4±204.2)ng/mL，n=3]、24 h[(1 456.0±363.6)ng/mL，n=3]与0 h[(245.00±10.84)ng/mL，n=3]比较，明显升高(P<0.05)。见图2。

注：H9C2细胞培养液中miR-19a-3p 表达与0 h比较，*P<0.05；H9C2细胞中miR-19a-3p表达与0 h比较，#P<0.05

图1实时荧光定量检测miR-19a-3p表达水平

注：H9C2细胞培养液中LRP2 表达与0 h比较，*P<0.05

图2培养液LRP表达水平

注：H9C2细胞中LRP2 表达与0 h比较，*P<0.05

图3 qRT-PCR检测miR-19a-3p表达水平

2.3H9C2细胞中LRP2 mRNA表达的结果比较 H9C2细胞中LRP2表达在缺氧16 h后明显升高，缺氧16 h[(0.000 503±0.000 100)ng/mL，n=3]、20 h[(0.001 303±0.000 090)ng/mL，n=3]、24 h[(0.001 617±0.000 110)ng/mL，n=3]与0 h[(0.000 139±0.000 060)ng/mL，n=3]比较，明显升高(P<0.05)。见图3。

2.4LRP2蛋白表达结果比较 对0、20、24 h H9C2细胞中LRP2蛋白表达进行检测，20 h[(0.235 000±0.003 427)ng/mL，n=3]、24 h[(0.535 000±0.003 427)ng/mL，n=3] LRP2蛋白表达与0 h[(0.140 10±0.018 21)ng/mL，n=3]比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

注：A表示蛋白印记结果；B表示相应统计分析结果，***P<0.000 1

图4 LRP2蛋白表达水平

3 讨 论

随着生活水平的提高及人口老龄化的加速发展，我国AMI发病率持续升高，其将带来严重的公共卫生问题[13]。近年来关于miRNA与AMI的研究较多，大量miRNA可能参与AMI的发生、发展，如miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-200、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499、miR-486等都可能参与了AMI的发病机制[14-18]。随着循环miRNA(主要指血浆、血清、尿液、细胞培养液等miRNA)的发现，大量研究表明循环miRNA与AMI的发病机制密切相关，并可作为AMI的生物标志物，尤其是循环miR-1、miR-133a/b、miR-208a、miR-499的研究较为成熟[19-22]。最近也有研究报道miR-19a-3p与AMI发病高度相关，且血浆和血清中的miR-19a-3p也可能与AMI有关[10]。本研究从AMI病理生理分析，采用H9C2细胞缺氧在细胞水平模拟AMI过程，对细胞水平和循环miRNA水平(培养液)进行miR-19a-3p检测，分别对缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2细胞培养液中miR-19a-3p进行定量检测，结果表明H9C2细胞培养液中miR-19a-3p的表达在缺氧0、4、8、12、16 h时，差异无统计学意义(P>0.05)，未见明显变化；而缺氧20、24 h时，miR-19a-3p表达与缺氧0 h比较，明显升高(P<0.05)。同时对H9C2细胞中的miR-19a-3p进行检测，结果显示缺氧20、24 h时，H9C2细胞中miR-19a-3p表达与缺氧0 h比较，明显下降(P<0.05)，证实H9C2细胞中miR-19a-3p的表达随缺氧时间延长而下降，但培养液中循环miR-19a-3p表达却相应升高，与有关研究一致，提示miR-19a-3p可能与AMI有关。

生物信息学分析发现，LRP2可能为miR-19a-3p的靶基因，且LRP2生物信息学功能主要是参与lipoprotein transporter activity、low-density lipoprotein receptor activity、lipid metabolic process、lipoprotein transport、coronary vasculature development、aorta development、cell proliferation、ventricular septum development、clathrin-coated vesicle membrane、lysosome等，可见其与脂蛋白代谢和冠状动脉发育等密切相关，可能也与AMI发病机制有关[23-24]。本研究分别对缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2细胞培养液中LRP2进行检测，结果表明H9C2细胞中LRP2表达在缺氧16 h后明显升高，缺氧16、20、24 h较0 h明显升高(P<0.05)，且在H9C2细胞中进行mRNA水平和蛋白水平检测均显示，LRP2表达在20、24 h较0 h时明显升高(P<0.05)，结合miR-19a-3p逐渐低表达的结果，提示LRP2可能为miR-19a-3p的靶基因，且LRP2可能也与H9C2细胞缺氧损伤密切相关。

生物信息学显示LRP2在正常组织中(HPA RNA-seq normal tissues，BioProject:PRJEB4337)主要表达于肾脏、甲状腺、大脑等，心脏表达较少；通过对胚胎发育过程中组织(tissue-specific circular RNA induction during human fetal development，BioProject:PRJNA270632)进行测序发现，LRP2主要在心脏、肾脏、肺组织中高表达。提示LRP2可能还参与了其他系统的生长发育和疾病的发生、发展。

综上所述，miR-19a-3p在H9C2细胞缺氧后差异性表达，其在H9C2细胞中低表达，在培养液中循环miR-19a-3p水平高表达，其靶基因可能为LRP2，后者在H9C2细胞缺氧后高表达，为AMI的发病机制提供了相关理论依据。本研究只是一个初步研究，关于miR-19a-3p在H9C2细胞中逐渐低表达而在培养液中逐渐高表达的机制也未进行探讨，可能与细胞旁分泌、外泌体运输或细胞破裂等有关。对于miR-19a-3p如何具体通过调控LRP2导致H9C2细胞缺氧损伤的过程还有待深入的细胞实验和动物实验进行验证。

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