金思维对东莨菪碱致记忆障碍小鼠脑胆碱能系统的影响

董云芳，冯慧利，陈芳，盛宁，任映，杨金铎，时晶，田金洲，王蓬文,，*

(1. 北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室，北京 100700； 2. 北京中医药大学神经变性病研究所，北京 100700)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD)是一种很常见的神经变性疾病，以痴呆为主要特点，病情进行性加重。 目前，全世界有患者4 700万人，预计到2050年将超过1.31亿人[1]。AD的病理特征是β-淀粉样蛋白(beta-amyloid peptide, Aβ)的沉积和神经原纤维物缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)，神经元缺失和神经递质功能障碍等[2]。在临床上，短期记忆的损伤和认知功能逐渐减退是AD患者的首发症状之一。随着患者病情逐渐恶化，开始表现出其他症状，包括长期记忆丧失、混乱、语言障碍、睡眠-觉醒周期紊乱、情绪波动、身体功能丧失甚至死亡。AD的发病机制非常复杂。中枢神经系统的胆碱能神经是构成学习记忆的重要生物学和解剖学基础，在20世纪70年代就发现AD脑内胆碱能神经元相对选择性退变，目前多数学者认为脑内胆碱能系统的损害是造成AD的重要原因[3]。

中药复方金思维 (a combination of Chinese herbs ginseng,Acorustatarinowii,Polygala, tuber Curcuma, and others, GAPT) 是由人参、淫羊藿、石菖蒲、肉苁蓉、远志、郁金等中药组成的，全方共奏补气益肾、化痰活血的功效，临床研究发现其可提高轻度AD患者的总体认知功能，而且还可以改善患者的注意力[4]，实验研究也发现金思维提取物对淀粉样前体蛋白、糖原合成酶激酶3β和CaMKⅡ表达水平表达有影响[5-7]，但对直接关系到早期学习记忆能力的胆碱能系统的影响尚不清楚。因此，本实验以东莨菪碱诱导建立记忆障碍模型，利用中药复方金思维进行干预，研究金思维对小鼠行为学及中枢胆碱能系统的影响，探讨金思维的神经保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

7周龄SPF级ICR小鼠108只，雄性，白色，体重33～35 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号【SCXK(京)2012-0001】，伦理审批号：16-20。小鼠的饲养、给药与取材均在北京中医药大学东直门医院屏障环境动物室进行【SYXK(京)2015-0001】。

1.1.2 试剂和仪器

中药复方金思维(人参、淫羊藿、石菖蒲、肉苁蓉、远志、郁金等)由北京中医药大学东直门医院制备；盐酸多奈哌齐(卫材(中国)药业有限公司，批号：140635)；氢溴酸东莨菪碱(产品批号：S1875)，购于美国Sigma公司；羧甲基纤维素钠(Carboxymethyl cellulose sodium, CMC)(批号：3405005),购于北京精求化工有限责任公司；乙酰胆碱(Ach)测定试剂盒，乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒(货号：A024)，胆碱乙酰转移酶(ChAT)测试盒(货号：A079-1)，均购于南京建成生物工程研究所；分光光度计(上海菁华科技有限公司)；Morris水迷宫实验设备(上海移数信息科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药

除每天上午定时灌胃给药以外，饲养期间动物自由摄食和饮水。通过SPSS 20.0统计软件产生随机数字，进行随机分组。将108只ICR小鼠随机分为正常对照组(0.5% CMC)、模型组(0.5% CMC)、阳性对照组(多奈哌齐组)按照0.92 mg/(kg·d)的剂量，溶于0.5% CMC，金思维大、中、小剂量组按照20、10、5 mg/(kg·d)剂量，溶于0.5% CMC，每组18只，按0.1 mL/10 g小鼠体重连续灌胃给药每天1次，共30 d。

1.2.2 造模方法

在末次小鼠灌胃1 h后造模，对照组腹腔注射生理盐水，其余各组腹腔注射东莨菪碱 3 mg/(kg·d)，溶于0.9%生理盐水，按0.1 mL/10 g小鼠体重腹腔注射。

1.2.3 Morris 水迷宫实验

Morris 水迷宫检测小鼠的游泳时间、游泳距离和目标象限停留时间[8]。

1.2.4 小鼠皮层和海马中Ach含量、AchE及ChAT活性的测定

小鼠灌胃1个月后，脱颈，于冰上快速剥离脑组织(除去小脑)，将其用预冷生理盐水进行冲洗以除去血迹，然后用滤纸拭干进行称重，用生理盐水制成10%的脑组织匀浆，用低温离心机以3000～4000 r/min离心10 min，取上清液。用比色法测定小鼠脑组织匀浆中乙酰胆碱(Ach)含量、乙酰胆碱酯酶(AchE)及胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性。(具体实验步骤按照测试盒说明书进行)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 金思维对东莨菪碱致记忆障碍模型小鼠游泳距离的影响

从Morris水迷宫实验的整体结果来看，从第1天到第5天，小鼠的游泳距离虽有波动，但均呈减少趋势。模型组小鼠游泳距离与正常组相比，第1天至第5天差异均有显著性(P<0.01)；第1天仅金思维大剂量组与模型组差异有显著性(P<0.05)；第2天金思维大剂量组及中剂量组与模型组差异有显著性(P<0.05或P<0.01)；从第3天开始各干预组游泳距离均明显减少，各干预组与模型组比差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)(表1)。

2.2 Morris水迷宫实验测试各组小鼠的游泳时间

从第1天到第5天的整体结果来看，各组小鼠的游泳时间呈减少的趋势。模型组小鼠游泳时间与正常组相比，第1天至第5天差异均有显著性(P<0.01)。第1天仅金思维中剂量组的游泳时间与模型组差异有显著性(P<0.05)；第2天各干预组与模型组相比差异无显著性(P>0.05)；第3、4、5天各干预组与模型组相比差异有显著性(P<0.05或P<0.01)(表2)。

2.3 Morris水迷宫实验测试各组小鼠目标象限停留时间

在第6天Morris水迷宫空间探索实验中，模型组目标象限停留时间与正常组相比，差异有显著性(P<0.01)。各干预组与模型组比差异有显著性(P<0.01)，各干预组在目标象限的停留时间明显增长(表3)。

2.4 海马和皮层Ach含量

从皮层Ach含量的生化检测结果来看，模型组与正常组相比含量降低，两者有差异(P<0.05)；金思维中剂量和小剂量组与模型组比，Ach含量增加，两者差异有显著性(P<0.05或P<0.01)；多奈哌齐组和金思维大剂量组与模型组相比差异无显著性(P>0.05)。

表1 金思维对东莨菪碱致记忆障碍模型小鼠游泳距离的影响Tab.1 Effects of GAPT on swimming distance of the mice with scopolamine-induced memory impairment(±s, n =18)

注：与正常组相比，**P<0.01,*P<0.05；与模型组相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表2 金思维对东莨菪碱致记忆障碍模型小鼠游泳时间的影响Tab.2 Effects of GAPT on swimming time of the mice with scopolamine-induced memory impairment(±s, n=18)

注：与正常组相比，**P<0.01,*P<0.05；与模型组相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表3 金思维对东莨菪碱致记忆障碍模型小鼠目标象限停留时间的影响Tab.3 Effects of GAPT on retention time in ttarget quadrant of the mice with scopolamine-induced memory

注：与正常组相比，**P<0.01,*P<0.05；与模型组相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

从海马Ach含量的生化检测结果来看，模型组与正常组相比含量降低，两者差异有显著性(P<0.05)；多奈哌齐组与模型组相比差异无显著性(P>0.05)；金思维大剂量和小剂量组与模型组比，Ach含量明显增加，两者差异有显著性(P<0.01)；金思维中剂量组与模型组比，Ach含量增加，两者差异有显著性(P<0.05)。

同组小鼠皮层和海马中Ach含量比较结果发现，只有正常组皮层和海马中的Ach含量差异有显著性(P=0.049)，其他各组小鼠皮层和海马中Ach含量比较均差异无显著性(P>0.05)(表4)。

表4 皮层和海马中Ach含量及比较Tab.4 Comparison of the contents of Ach in the cortex and hippocampus(±s, n=8)

注：与正常组相比，**P<0.01,*P<0.05；与模型组相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

2.5 海马和皮层AchE活性

从皮层AchE活性的生化检测结果来看，模型组与正常组相比活性增加，两者差异有显著性(P<0.01)；多奈哌齐组、金思维大剂量和中剂量组与模型组比AchE活性降低，差异有显著性(P<0.05)；金思维小剂量组与模型组比AchE活性降低明显，两者间差异有显著性(P<0.01)。

从海马AchE活性的生化检测结果来看，模型组与正常组相比活性增加，两者差异有显著性(P<0.01)；多奈哌齐组、金思维大剂量和中剂量组与模型组比AchE活性降低明显，差异有显著性(P<0.01)。

同组小鼠皮层和海马中AchE活性比较结果发现，正常组皮层和海马间、金思维小剂量组皮层和海马间AchE活性差异无显著性(P>0.05)；模型组、多奈哌齐组、金思维大、中剂量组皮层和海马中AchE活性差异有显著性(P<0.01)，且皮层中AchE活性高于海马中AchE活性。(见表5)

2.6 海马和皮层ChAT活性

从皮层ChAT活性的生化检测结果来看，模型组小鼠ChAT活性低于正常组，两者有差异(P<0.05)；各干预组皮层ChAT活性与模型组比差异无显著性(P>0.05)。

从海马ChAT活性的生化检测结果来看，模型组小鼠ChAT活性明显低于正常组，两者差异有显著性(P<0.01)；多奈哌齐组、金思维大、小剂量组与模型组比ChAT活性增加，差异有显著性(P<0.05)；金思维中剂量组与模型组比ChAT活性差异有显著性(P<0.01)。

同组小鼠皮层和海马中ChAT活性比较结果发现，仅金思维大剂量组皮层和海马中ChAT活性有差异(P<0.05)，且海马中ChAT活性高于皮层中ChAT活性。(表6)

表5 皮层和海马中AchE活性及比较Tab.5 Comparison of the AchE activity in the cortex and hippocampus(±s, n=8)

注：与正常组相比，**P<0.01,*P<0.05；与模型组相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表6 皮层和海马中ChAT活性及比较Tab.6 Comparison of the activity of ChAT in the cortex and hippocampus(±s,n=8)

注：与正常组相比，**P<0.01,*P<0.05；与模型组相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

3 讨论

在中枢神经系统中，胆碱能神经元分布广泛, 它们主要存在于脊髓、后脑、内侧缰核、中脑区、基底前脑、纹状体和嗅结节等，几乎所有的脑区都受胆碱能神经元支配，所以胆碱能系统参与学习、记忆、应激反应、清醒和睡眠等重要的生理过程[9]。乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)是所有胆碱能神经元使用的神经递质，其在外周和中枢神经系统中具有非常重要的作用。主要功能是维持意识的清醒，促进学习和记忆的改善[10]。Ach是在胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase, ChAT)的催化作用下由胆碱乙酰辅酶A和胆碱合成的，Ach的分解靠乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)完成，ChAT和AchE共同维持Ach的稳态[11]。因此Ach是已知的与学习记忆关系最密切的中枢神经递质。ChAT在Ach的合成中具有重要的功能，其是分子量约为69 ×103的蛋白酶，主要位于胆碱能神经末梢的细胞质中[12]。AchE主要在脑和肌肉中表达。存在于脑中的AchE主要位于胆碱能系统中，是降解Ach的关键酶[13]。当胆碱能神经元被去极化时，Ach从突触小泡胞吐并释放到突触间隙中，在突触间隙中它可以活化mAchR和nAchR。存在于突触间隙的Ach被AchE快速降解，释放出胆碱和乙酸[14]，每个分子的AchE可以每秒水解5000分子的Ach，这使得AchE成为已知的最有效的酶之一[15]。

AD在胆碱能系统中的特征为在基底脑、海马神经元和大脑皮层中Ach含量不足、ChAT活性的降低和AchE活性的增加。早期研究发现严重痴呆患者皮质中ChAT活性明显降低，减少胆碱的吸收、Ach的释放和基底前脑胆碱能神经元的损失，证明AD患者皮层和海马突触前胆碱能缺陷。这些观察结果表明ChAT可能对学习和记忆发挥重要的促进作用。因此, ChAT活性下降可能在AD中扮演一个重要角色[16-17]。此外，AchE负责破坏脑中的Ach而导致记忆丧失和认知缺陷，因此AchE活性的增加也在AD的进展中扮演重要角色。直到现在AchEI也是治疗轻、中度AD的主要药物[18]。本实验中分别针对皮层和海马中Ach含量AchE和ChAT的活性进行了生化检测，这三者在胆碱能系统中对学习记忆发挥着重要的作用。因为Ach是维持意识清醒和促进学习记忆的重要神经递质，AchE和ChAT是Ach的水解酶和合成酶，共同调节Ach的代谢平衡，二者的活性代表了胆碱能神经功能的状态。金思维的重要组成药物之一人参具有补脾益肺、安神益智的功效，人参皂苷是人参的有效活性成分，研究发现人参皂苷能使Ach的摄取和释放增加，也有实验证明人参皂苷可降低东莨菪碱所致的记忆障碍模型小鼠AchE的活性[19]。淫羊藿是补益类中药, 黄酮类化合物、多糖、木脂素等为其主要化学成分。目前已证明淫羊藿苷可通过增加ChAT的活性，使Ach的合成增加改善学习记忆[20]。远志有安神益智、祛痰作用，研究证实远志对AD模型大鼠胆碱能系统损害有一定的保护作用[21]。

从本次实验结果来看，金思维可以使东莨菪碱导致的记忆障碍模型小鼠皮层和海马中Ach含量的增多、ChAT活性的增加和AchE活性的降低。所以金思维是通过减少AchE的活性使Ach的水解减少，通过增加ChAT的活性使Ach的合成增多达到改善胆碱能神经功能的目的。正是因为金思维中含有多种中药，很多研究也已表明多种中药中的有效成分都对胆碱能系统有影响，这也说明了金思维对胆碱能系统是通过多靶点、多位点、多途径来发挥神经保护作用，进一步改善小鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验，是检测小鼠学习记忆能力最经典的行为学实验之一[22]，本实验中金思维可以使东莨菪碱致记忆障碍模型小鼠的游泳距离和游泳时间变短，目标象限停留时间增长，也说明了模型小鼠的学习记忆能力有所改善。该模型从Ach结果来看对海马和皮层都有影响，没有差异，而AchE对海马影响更大。因此，金思维对模型减低的Ach、ChAT和升高AchE的海马和皮层的作用也不尽相同。AD疾病中海马Ach、AchE、ChAT这三种物质的作用更为重要，本次试验中结果金思维大剂量组皮层Ach含量没有显著增多，金思维小剂量组海马AchE活性没有显著降低，金思维大、中、小剂量组皮层ChAT活性没有显著增加，药物没有显著的剂量依赖性，仍需以后的实验中进一步探索。

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