接骨木籽油抗氧化、降血糖和降血脂生物活性的研究

胡伟，李辉，刘克武*

(1.黑龙江省林副特产研究所，黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江 牡丹江 ;2.黑龙江省肇源县气象局)

在食品和化妆品领域中，抗氧化剂在阻止氧化反应中具有重要作用。而且随着生活水平的提高，人们更加注重生活质量，且因目前越来越多的化学合成抗氧化剂的安全性受到挑战，人们开始追求绿色、安全以及高效的抗氧化剂，因此纯天然食品抗氧化剂倍受青睐。在很多天然产品中，许多植物油因其对身体有益且无副作用而被广泛使用[1]。降血糖活性是通过减少体内葡糖糖的吸收进行的，它是一种有效控制膳食的方法[2]。α-葡萄糖苷酶可以加快膳食多糖中葡糖糖的吸收，所以控制α-葡萄糖苷酶可以控制葡糖糖的吸收[3]。高血脂通常被认为是导致心血管疾病的一个重要因素[4]。很多化学药物具有降血脂的功效，但是它们具有副作用并会导致药物依赖性[5]。相反，天然植物及其提取物在预防和治疗高血脂时，具有多功能性且无副作用。

考虑以上问题，本项课题主要研究了接骨木籽油的抗氧化、降血糖和降血脂活性。接骨木籽油抗氧化活性研究的报道相对较少，实验选用 DPPH法和普鲁士蓝法来测定其体外清除DPPH自由基的能力及对其还原力进行了初步的研究；实验采用体外研究接骨木籽油对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，研究其降血糖活性；采用高血脂小鼠模型，通过灌胃接骨木籽油，研究该油脂的降血脂活性。

1 实验材料与试剂

接骨木籽油：江山娇实验林场接骨木(Sambucuswilliamsii)实验地采种, 超临界CO2萃取得到。

DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)产自日本东京化成工业株式会社；抗坏血酸(L-Ascorbic Acid)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸(TCA)、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、磷酸钾缓冲液(pH=6.8)、无水碳酸钠，国药集团化学试剂有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷( pNPG)，α-葡萄糖苷酶，谷胱甘肽，购买于上海梦泽生物科技有限公司；拜唐苹(每片含50mg阿卡波糖)购自药房；ICR小鼠：雄性，体重22±2g，购买于上海实验动物研究中心；基础饲料：购买于上海实验动物研究中心；高脂饲料：Research Diets D12492，上海基剑生物科技有限公司；总胆固醇(TC)测定试剂盒，上海梦泽生物科技有限公司；甘油三酯(TG)测定管试剂盒，上海梦泽生物科技有限公司；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒，上海梦泽生物科技有限公司。

2 主要仪器与设备

752N 紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；FA2104 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；CT14RD 台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；HH-S11-2-S型电热恒温水浴锅，上海新苗医疗器械制造有限公司。96孔板，上海基星生物科技有限公司；SH-1000 Lab酶标仪，广州济恒生物科技有限公司；CT14RD台式告诉冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司。

3 接骨木籽油的抗氧化活性

目前，国内外用于体外测定样品抗氧化活性的方法主要有DPPH法、普鲁士蓝法、FRAP法、TRAP法和ABTS法[6]。结合上述方法中的几种，可全面客观地测定待测样品的抗氧化性，操作简单、快速且样品消耗量少。

本实验主要采用DPPH法与普鲁士蓝法2种方法结合的方式测定接骨木籽油的抗氧化活性，以抗坏血酸VC作为阳性对照，IC50值为量化标准。

3.1 DPPH自由基清除法测定抗氧化性

3.1.1 DPPH检测波长的确定

在有机溶剂中，因为苯环的共轭位阻和硝基的吸电子作用，DPPH分子会生成一个稳定的含氮自由基，它的孤对电子在518nm处有特征吸收峰，呈紫色。当它与自由基清除剂相互作用的时候，其孤对电子就会被配对，此时吸收会减弱，溶液的紫色就会逐渐变浅(图1)，因此溶液的特征吸收峰就会下降，吸光值降低，反应结束后达稳定[7-8]。

本实验选择518nm作为检测波长，采用紫外分光光度法对接骨木籽油的抗氧化活性强弱进行定量分析。

图1 DPPH自由基清除原理

3.1.2 DPPH溶液的配制

准确称取0.0394gDPPH，用无水乙醇溶解并定容至100mL容量瓶中，得到1mmol/L的DPPH储备液，摇匀后置于4℃冷藏备用。实验前，用无水乙醇稀释至0.2mmol/L即可。

3.1.3 DPPH自由基清除率的测定

将接骨木籽油用无水乙醇溶解，配制成一系列浓度(6.25，12.5，25，50，75，90，100mg/mL)，取2mL后加入0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL于试管中制成反应液。迅速混匀，置于暗处，在室温下静置，待反应体系稳定后，在518nm处分别测定各待测样品的吸光度。以抗坏血酸(VC)对DPPH自由基清除能力作为阳性对照。每个样品浓度平行测3次，取平均值。根据下列公式计算各样品对DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(I %)=(1-As/Ao)×100%[9]

As：待测样品的吸光度；

Ao：无待测样品的(2mL 0.2mmol/L DPPH+2mL无水乙醇)吸光度。

3.1.4 半数抑制浓度(IC50)的计算

以各待测样品的质量浓度(mg/mL)对DPPH自由基清除率(%)作图并线性拟合，得到线性回归方程，并计算IC50值(即清除率为50%时，对应的样品的浓度)。以IC50值作为评价各待测样品抗氧化能力的参考指标。

3.2 普鲁士蓝法测定总还原能力

3.2.1 普鲁士蓝法的原理[10-11]

还原力的测定是为了检验待测样品是否有良好的电子供应能力。由还原能力强的物质供应的电子一方面可以还原氧化性物质，另一方面也可以与自由基发生反应从而使自由基成为稳定的物质。

当反应体系中有还原性物质时，铁氰化钾会被还原成亚铁氰化钾，它在酸性条件下可与三氯化铁反应生成普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3)，其在700nm 处有最大吸收峰。待测样品的还原力越强，反应溶液的吸光度就越大，所以用700nm处的吸光度A700来表示待测样品的总还原能力，以此还原能力评价其抗氧化性。

3.2.2 普鲁士蓝法的测定方法

取1mL不同浓度的各待测样品置于试管中，分别加入2.5mL磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)和2.5mL 1%六氰合铁酸钾溶液(K3Fe(CN)6)，在50℃的水浴中放置20min后冷却，加入2.5mL 10%的三氯乙酸，以3000r/min 离心10min后取5mL上清液，然后再依次加入5mL 蒸馏水和1mL0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min。以蒸馏水代替样品做空白对照，700nm处测定吸光度，每个样品浓度测3次，取其平均值[12]。

本实验以抗坏血酸(VC)为阳性对照评价各待测样品的总还原能力强弱。

4 接骨木籽油的降血糖活性

α-葡萄糖苷酶可以催化4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)生成葡萄糖和对硝基酚(pNP)。在400nm波长处，pNP具有特征吸收峰，葡萄糖和pNPG在此波长下的紫外吸收可忽略不计。所以，通过测定400nm波长下反应体系的吸光度判断样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用的大小[13]。

4.1 确定最佳底物浓度

将1mL磷酸钾缓冲液(67mmol/L，pH=6.8)，0.2mL谷胱甘肽溶液(3mmol/L)，0.2mL α-葡萄糖苷酶溶液(0.04mg/mL)，0.4mL蒸馏水依次加入到试管中，置于37℃水浴中保温10min，再加入0.5mL的pNPG溶液(c=0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)混匀，37℃水浴20min，最后加入8mL碳酸钠溶液(0.1mol/L)以终止反应，测定400nm处的吸光度。

4.2 确定最佳反应时间

将1mL磷酸钾缓冲液(67mmol/L，pH=6.8)，0.2mL谷胱甘肽溶液(3mmol/L)，0.2mL α-葡萄糖苷酶溶液(0.04mg/mL)，0.4mL蒸馏水依次加入到试管中，置于37℃水浴中保温10min，再加入0.5mL的pNPG 溶液(0.2mg/mL)混匀，37℃水浴不同时间(10、15、20、25、30min)，最后加入8mL碳酸钠溶液(0.1mol/L)以终止反应，测定400nm处的吸光度。

4.3 测定接骨木籽油对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

将1mL磷酸钾缓冲液(67mmol/L，pH=6.8)，0.2mL谷胱甘肽溶液(3mmol/L)，0.2mL α-葡萄糖苷酶溶液(0.04mg/mL)，0.4mL不同浓度的待测样品溶液(1.56、3.12、6.24、12.5、25mg/mL)依次加入到各个试管中混匀，置于37℃水浴中保温10min，再加入0.5mL的pNPG 溶液(0.2mg/mL)混匀，37℃水浴10min，最后加入8mL碳酸钠溶液(0.1mol/L)以终止反应，测定400nm处的吸光度，记为A1。

另取2支试管做对照，其中一支不加底物pNPG，另一支不加油样，其他步骤同试管1，测定400nm处的吸光度，分别记为A2和A3。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100%

5 接骨木籽油的降血脂活性

5.1 实验对象与分组

选取25只雄性6周龄ICR小鼠，随机分为5组：空白对照组(NC)、高脂模型对照组(HFC)、接骨木籽油低剂量组(LSW)、接骨木籽油中剂量组(MSW)、接骨木籽油高剂量组(HSW)。空白对照组饲以基础饲料，其余各组均饲以高脂饲料。每天记录进食量，称体重。

5.2 实验动物饲养条件

动物房的环境温度控制在26±2℃，湿度控制在60% ± 10%，自然采光，自然昼夜，室内环境保持清洁，定期通风换气；老鼠垫料要保持卫生干燥，每隔一天更换垫料。实验期间，实验动物自由饮水和摄食。所有的程序都严格按照上海海洋大学实验动物使用和管理指南。

5.3 高血脂模型的建立

小鼠除空白对照组外，其余各组以高脂饲料(Research Diets D12492)喂养诱导高血脂的形成。称重并做记录，各组间体重差异无统计学意义。15天后，选取各组小鼠，称重后，眼眶静脉取血测定血清的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平，以确定高脂模型是否成功建立。

5.4 接骨木籽油的降血脂实验

在高血脂症模型建立成功后，对这5组小鼠饲喂饲料的同时，灌胃生理盐水和不同剂量的接骨木籽油。其中，空白对照组继续饲以基础饲料并灌胃生理盐水，高脂模型对照组继续饲以高脂饲料并灌胃生理盐水，低、中、高3个剂量组均饲以高脂饲料并分别灌胃1、2、4g/kg·d剂量的接骨木籽油。每两天定期称重，观察各实验组小鼠体重有无显著性差异。30天后将小鼠禁食12h，称重后眼眶静脉取血，测定血清中的TC，TG，HDL-C的水平，其中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)=TC-(TG/5+HDL-C)，致动脉硬化指数A I=(TC-HDL-C)/HDL- C，抗动脉硬化指数AAI=HDL-C/TC。各指标的结果用x±s表示，组间显著性差异均采用t检验进行分析。

6 结果与讨论

6.1 接骨木籽油的抗氧化活性

6.1.1 接骨木籽油对DPPH自由基的清除

6.1.1.1 反应时间对DPPH自由基的影响

图2 接骨木籽油对DPPH清除率随时间变化曲线

图2和图3分别为不同浓度接骨木籽油(6.25、12.5、25、50、100mg/mL)和VC在不同时间对DPPH自由基的清除率。从图中我们可以看出二者达到反应平稳时间不一，接骨木籽油对DPPH清除率在基本在250min时达到反应平衡时间。作为对照的VC在反应开始后15min内清除率骤升，15～20min对自由基清除趋于平缓，30min后反应达稳定。

图3 VC对DPPH清除率随时间变化曲线

6.1.1.2 待测样品清除DPPH自由基的剂量效应

根据以上选择的测定波长和反应时间，检测不同浓度的接骨木籽油对DPPH自由基的清除率，并计算其IC50值。

图4 接骨木籽油对DPPH自由基清除率线性拟合曲线

如图4所示，DPPH自由基的清除率和待测样品的浓度具有良好的量效关系，得到以下线性回归方程：y=0.6622x+9.4084，R2=0.9992。通过计算可知，接骨木籽油清除DPPH自由基的 IC50值为 61.30 ± 0.88mg/mL。

6.1.2 总还原力的测定结果

通过测定样品的还原力可以判断样品是否是良好的电子供体。还原力强的物质，可以提供更多的电子参加自由基反应，从而使自由基形成稳定的物质[1]。

图5 不同浓度接骨木籽油的总还原力

图6 不同浓度的VC总还原力

图5和图6显示了不同浓度的接骨木籽油和VC的总还原能力。从图5～6中可以看出，接骨木籽油具有还原能力，且随着接骨木籽油浓度的增加，700nm处吸光度逐渐升高，还原能力与其质量浓度存在良好的量效关系：y=0.0555x+0.0450，R2=0.9914。所以接骨木籽油具有还原能力，不过其还原能力弱于对照品VC。

6.2 接骨木籽油的降血糖活性

6.2.1 最适底物浓度的确定

0.04mg/mL的α-葡萄糖苷酶与不同浓度的底物pNPG反应中，底物浓度优化的结果如图7所示。

图7 底物浓度优化

从图7中可以看出，随着pNPG浓度的增加，由α-葡萄糖苷酶催化pNPG生成的pNP在400nm处的吸光值也相应增加，且当pNPG浓度为0.2mg/mL时，吸光值最佳。所以最佳底物浓度选择0.2mg/mL。

6.2.2 最佳反应时间的确定

反应时间的优化结果如图8所示。从图8中可知，反应过程中PNG 的生成量随着反应时间的延长而逐渐升高，但是其增长的幅度很小，30min处的吸光值比10min时的吸光值仅增加了10.39%。所以为了提高实验的效率，最佳反应时间选择10min。

图8 反应时间的优化

6.2.3 接骨木籽油对α-葡萄糖苷酶的抑制实验结果

接骨木籽油对α-葡萄糖苷酶的抑制作用结果如图9所示。结果表明，接骨木籽油在 1.56～25mg/mL浓度范围内对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果。抑制效果与油脂的浓度呈良好量效关系：y=0.9349x+61.883，R2=0.9998。相应的抑制在62.66%到85.22%之间，抑制率明显高于阳性对照品阿卡波糖(47.45%)。根据实验结果可知接骨木籽油具有降血糖活性，食用其可以降低体内血糖水平和控制膳食。

图9 不同浓度接骨木籽油对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

6.3 接骨木籽油的降血脂活性

6.3.1 试验期间小鼠体重的变化

整个实验不同阶段小鼠的体重变化见表1。表1列出了实验初(小鼠刚购买回来时)、实验中(15天后建模成功时)以及实验结束后(灌胃饲以接骨木籽油15天后)各组小鼠体重的平均值。从表1可以看出，与空白对照组比较，饲以高脂饲料的小鼠体重明显高于空白组，且大约重3g左右，说明了高脂模型建立成功。在30天后，实验周期结束时，比较高脂模型对照组和接骨木籽油低、中、高剂量组的小鼠的体重，发现接骨木籽油剂量组小鼠的体重明显低于高脂模型组，且低3g左右，这说明接骨木籽油在一定程度上能调节小鼠的体重，有一定的减肥功效。

表1 不同阶段小鼠的体重

6.3.2 接骨木籽油对小鼠血脂的影响

接骨木籽油对小鼠血脂的影响见表2。由表2 可以看出，高脂模型对照组与空白对照组比较，血清TC、TG、LDL-C水平极显著升高(P<0.01)，HDL-C水平极显著下降(P<0.01)，说明高血脂小鼠模型建立成功。

接骨木籽油低、中、高剂量3个实验组与高脂模型对照组比较，血清TC、TG、LDL-C水平极显著(P<0.01)降低，HDL-C水平显著升高(P<0.05)，说明接骨木籽油能有效降低高血脂小鼠血清中的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的水平，有效升高高密度脂蛋白胆固醇的水平，所以接骨木籽油可以降低小鼠血脂，故具有降血脂的作用。此外，比较这3个剂量实验组，可以发现接骨木籽油剂量越多，小鼠血脂水平下降的效果越明显，说明接骨木籽油的降血脂作用具有剂量依赖性。

表2 接骨木籽油对高血脂小鼠血清的血脂水平的影响

6.3.3 接骨木籽油对小鼠动脉硬化指数的影响

接骨木籽油对小鼠动脉硬化指数的影响见表3。从表3可以看出，高脂模型对照组小鼠致动脉硬化指数(AI)高于空白对照组(P<0.01)，说明建模成功。接骨木籽油低、中、高剂量3个实验组小鼠的致动脉硬化指数(AI)明显低于高脂模型对照组，抗动脉硬化指数(AAI)则明显高于高脂模型对照组，且均有剂量依赖性。所以，接骨木籽油可以有效预防动脉硬化的发生。

表3 接骨木籽油对小鼠动脉硬化的影响

注：1. a,*，a,**，b,*，b,**同表2；
2. AI=(TC-HDL-C)/HDL-C；AAI=HDL-C/TC。

7 结论

本章通过DPPH自由基体外清除模型的优化，采用紫外分光光度计以518nm为检测波长，以VC作对照，IC50值为评价标准，测定了接骨木籽油的自由基消除能力，客观评价其抗氧化活性。实验结果表明,接骨木籽油可以有效清除自由基。采用普鲁士蓝法对待测样品进行总还原力检测，反应后体系溶液颜色改变程度即体系中氧化还原状态的变化。实验结果显示接骨木籽油具有还原能力，2～10mg/mL浓度范围内存在显著量效关系。接骨木籽油作为天然植物可兼顾稳定性好、毒副作用小、效果较强等优点，具有进行新型抗氧化剂开发的价值。

通过测定接骨木籽油对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，研究接骨木籽油的降血糖活性。接骨木籽油在 1.56～25mg/mL浓度范围内可以有效抑制α-葡萄糖苷酶，且效果明显高于阳性对照品阿卡波糖(47.45%)。所以接骨木籽油可以降低体内血糖水平和控制膳食，开发利用该天然资源具有良好前景。

通过给高血脂动物模型灌胃接骨木籽油并测定血脂水平，研究接骨木籽油的降血脂活性。实验结果也表明,接骨木籽油能有效降低高血脂小鼠血清中的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的水平，有效升高高密度脂蛋白胆固醇的水平，故其可以降低小鼠血脂，具有降血脂的作用。而且接骨木籽油的降血脂作用具有剂量依赖性。此外，接骨木籽油可以降低致动脉硬化指数，提高抗动脉硬化指数，故其可以有效预防动脉硬化的发生。

所以接骨木籽油具有抗氧化、降血糖和降血脂的生物活性。食用该油脂对人体健康十分有益。对接骨木籽油的开发利用具有广阔的市场前景。

[1]Ebrahimabadi, A. H., Ebrahimabadi, E. H., Djafari-Bidgoli, Z., Kashi, F. J., Mazoochi, A., & Batooli, H. Composition and antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and extracts of Stachys inflata Benth from Iran[J]. Food Chemistry, 2010,119, 452-458.

[2]Kim, J. S., Hyun, T. K., & Kim, M. J. The inhibitory effects of ethanol extracts from sorghum, foxtail millet and proso millet on α-glucosidase and α-amylase activities[J]. Food chemistry, 2011,124, 1647-1651.

[3]Wang, S. Y., Camp, M. J., & Ehlenfeldt, M. K. Antioxidant capacity and α-glucosidase inhibitory activity in peel and flesh of blueberry (Vaccinium spp.) cultivars[J]. Food chemistry, 2012,132, 1759-1768.

[4]Cho, H., Cho, K. A., Jia, S., Cho, S. J., & Choi, D. B. Influence of bamboo oil supplementation on blood lipid concentration in serum[J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2009,15, 281-284.

[5]Feng, L. J., Yu, C. H., Ying, K. J., Hua, J., & Dai, X. Y. Hypolipidemic and antioxidant effects of total flavonoids of Perilla Frutescens leaves in hyperlipidemia rats induced by high-fat diet[J]. Food Research International, 2011,44, 404-409.

[6]纪俊敏. 生物体系中脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性的榆测与评价[J].中国油脂, 2004,29(07):33-37.

[7]郭雪峰, 岳永德, 汤锋, 等. 清除有机自由基DPPH法评价竹叶提取物抗氧化能力[J].光谱学与光谱分析, 2008,28(07):578-1582.

[8]Dalia Hamdan , Mahmoud Zaki El-Readi , Ahmad Tahrani , et al. Chemical composition and biological activity of Citrus jambhiri Lush[J].Food Chemistry, 2011,127(2):394-403.

[9]Yen, G. C., & Duh, P. D. Scavenging effect of methanolic extracts of peanut hulls on free radical and active-oxygen species[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1994,42, 629-632.

[10]展锐, 库尔班, 苟萍, 等. 火绒草提取物抗氧化活性的研究[J]. 食品科学,2010,31(03):153-159.

[11]lhami Gülcin. Antioxidant activity of caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid)[J]. Toxicology. 2006,217(02-03): 213-220.

[12]Su X Y, Wang Z Y, Liu J R. In vitro and in vivo antioxidant activity of Pinus koraiensis seed extract containing phenolic compounds[J]. Food Chemistry, 2009, 117(04):145-147.

[13]李知敏, 彭亮. 灰兜巴体外抑制α-葡萄糖苷酶的活性研究[J]. 时珍国医国药，2012, 23(06): 1379-1380.