龙胆泻肝汤加减对寻常型银屑病患者p38MAPK/IL-17信号通路的影响❋

雷 鸣，李伟宁，姚 斌，邵文超，张晓杰△

(1. 山东中医药大学，济南 250014； 2. 宁夏银川市中医医院，宁夏 银川 750001； 3. 山东中医药大学附属医院，济南 250014； 4. 宁夏中宁县中医院，宁夏 中宁 755100； 5. 宁夏贺兰县中医医院，宁夏 贺兰 750200)

银屑病(Psoriasis)又名“牛皮癣”，是一种常见且极易复发的慢性炎性皮肤病，主要病理表现为表皮角化过度、角质形成细胞过度增生[1-2]，其病因尚未明确。新近发现的CD4+T细胞Th17亚群及其相关细胞因子与该病发生发展密切相关[3-4]。原始T细胞在TGF-β和IL-6的作用下向Th17细胞分化，成熟的Th17细胞分泌IL-23和IL-17，前者正反馈促进Th17细胞的分化成熟并维持其稳定性[5-6],后者与其相应受体结合后激活下游p38MAPK信号通路[7]，继而上调IL-6的表达。此外，IL-17还可通过上调IL-8的表达诱导炎性细胞在银屑病皮损处聚集引起表皮过度角化[8]。那么龙胆泻肝汤加减治疗银屑病是否通过p38MAPK/IL-17信号通路发挥作用，目前尚未见相关报道。本研究就寻常型银屑病患者皮损中p38MAPK基因水平及患者口服龙胆泻肝汤加减治疗前后外周血Th17细胞相关细胞因子表达水平总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

基因检测部分：10例银屑病患者来自于我院皮肤科门诊2015年1月至4月就诊患者，其皮损取自于我院皮肤科门诊行病理检测(经皮损表现和病理报告均证实为银屑病)的皮肤组织(病理结果见附图)，对照组皮肤组织取自外科手术患者切除的正常皮肤。

临床实验部分： 2015年5月至2016年4月就诊我院皮肤科门诊的42例经龙胆泻肝汤加减治疗寻常型银屑病患者，其中男18例，女24例，年龄18～58岁，平均年龄(39.4±2.3)岁;病程3个月～20年，平均病程(12.8±1.3)年。皮损严重指数(PASI)评分按标准[9]计算14.3～28.4分，平均(19.37±2.32)分。健康对照组30例来自我院体检者，其中男16例，女14例，年龄22～57岁，平均年龄(36.1±3.3)岁。2组性别、年龄等资料经统计学比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 仪器和试剂

ELISA试剂盒(北京索莱宝)，反转录试剂盒(00255982，Thermo)，PCR试剂(appled biosystems)，TRNzol Reagent(DP405，天根)， PCR仪(T100TM，Bio-Rad)，电泳成像系统(Tanon1600，天能)，酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo)。

1.3 诊断标准[10-11]

西医诊断标准：具有典型临床表现，皮损以丘疹、斑丘疹和大小不等的红色斑块上覆有多层干燥银白色鳞屑皮疹，刮去鳞屑可见一层光亮薄膜，薄膜下可见点状出血，进行期不断有新皮疹出现，有同形反应；皮损形态可为点滴状、斑块状、钱币状、地图状、混合状等类型；本病经过缓慢，有自限性、易复发，可伴有不同程度的瘙痒；好发于头皮、四肢伸侧及腰骶部。发于头皮者，毛发呈束状；发于甲板(指、趾)者，可有顶针样凹陷或前沿剥离；病理符合银屑病角化不全、角化过度、Munro微脓疡；棘层增厚，表皮突下延；真皮乳头上伸接近角质层，真皮上层血管扩张，血管内皮增生，周围有圆形细胞浸润。

中医诊断标准：主症：皮损鲜红；新出皮疹迅速扩大或者不断增多。次症：心烦易怒；小便黄；舌质红或绛；脉弦滑或数。具备所有主症和1项以上次症即可诊断。

1.4 方法

1.4.1 p38MAPK基因检测 根据p38MAPK和GAPDH基因序列设计并合成PCR物:p38MAPK-F: CTCCATAATGGCCGAGCTGT，p38MAPK-R: CC TGTTCTGTCGCGAT；GAPDH-F:AAATCCCATCACCATCTTCC，GAPDH-R:CTGCCCTTT GGCC。提取银屑病患者皮损处皮肤组织和外科手术切取的正常皮肤组织总RNA，反转为cDNA，以 cDNA 为模板，PCR法检测目的基因的表达情况。

1.4.2 细胞因子检测 分别采取健康对照者和银屑病患者经龙胆泻肝汤加减治疗前后外周血4 mL，待其自然凝固后离心取上清，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，检测血清中细胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及TGF-β的表达情况。

1.4.3 治疗方法 龙胆泻肝汤加减方：金银花12 g，土茯苓30 g，柴胡9 g，龙胆草9 g，山栀子9 g，黄芩9 g，蒲公英30 g，生地黄15 g，车前子(包煎)15 g，当归9 g，泽泻9 g，丹皮15 g，甘草6 g，连翘15 g。水煎取汁400 mL，分2次于早、晚饭后1 h温服，7 d为1个疗程，共4个疗程。

1.4.4 PASI评分标准[9]按患者皮损面积和严重程度进行PASI评分：皮损严重程度按照有无红斑、浸润、鳞屑分为无、轻、 中、重、极重，分别计0～4分; 皮损面积按照无皮损、皮损面积 <10%、 10%～30%、 30%～50%、50%～70%、70%～90%、90%～100%分别计0～6分。PASI总分=(0.1×头部皮损面积损×严重程度)+(0.2×上肢皮损面积损×严重程度)+(0.3×躯干皮损面积损×严重程度)+(0.4×下肢皮损面积损×严重程度)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 基因检测结果

10例银屑病患者与健康对照组检测结果。

2.1.1 p38MAPK基因表达情况 图1显示，与健康对照组比较，10例银屑病患者皮损处p38MAPK基因表达水平均有不同程度的增高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

图1 PCR检测10例银屑病患者皮损处与健康对照组p38MAPK 基因的表达情况注：与健康对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

2.1.2 p38MAPK基因与PASI 评分相关性分析 10例银屑病患者皮损处p38MAPK基因表达水平与PASI评分呈正相关(r=0.853，P<0.01)。

2.1.3 外周血IL-17、IL-6表达情况 表1显示，与健康对照组比较，10例银屑病患者外周血中细胞因子IL-17、IL-6含量均升高，且升高程度有统计学意义(P<0.01)。

2.1.4 患者p38MAPK基因与IL-17、IL-6相关性分析 表2显示，10例银屑病患者外周血IL-17、IL-6的含量与患者皮损处p38MAPK基因的表达水平呈正相关(P<0.01)。

表1 10例银屑病患者与健康对照组外周血细胞因子IL-17、IL-6表达比较

注：与对照组比较:**P<0.01

表2 10例银屑病患者外周血细胞因子IL-17、IL-6与皮损处p38MAPK基因相关性分析

2.2 临床实验部分

42例经龙胆泻肝汤加减治疗银屑病患者与健康对照组检测结果。

2.2.1 患者治疗前后PASI 评分比较 治疗前患者PASI评分(19.37±2.32)分，经龙胆泻肝汤加减治疗4个疗程后，患者PASI评分(4.76±1.30)分较治疗前差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2.2 患者治疗前后与健康对照组5种细胞因子表达情况 表3显示，与健康对照组比较，银屑病患者外周血相关细胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23以及TGF-β表达水平均有不同程度升高(P<0.05)，经龙胆泻肝汤加减治疗4个疗程后，患者外周血中各细胞因子的表达水平明显下降(P<0.05)。

表3 各组样本外周血5种细胞因子表达比较

注：通过Levene方差齐性检验得出，3组数据均符合方差齐性(P=0.824>0.05)，故均采用One-way ANOVA检验对3组之间进行比较差异有统计学意义

2.2.3 治疗组患者治疗前后5种细胞因子与PASI 评分相关性分析 表4显示，银屑病患者治疗前后外周血5种细胞因子(IL-6、IL-8、IL-17、IL-23和TGF-β)的表达水平均与PASI评分呈正相关(P<0.05，P<0.01)。

表4 银屑病患者治疗前后外周血5种细胞因子表达水平与PASI评分相关性分析

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性皮肤疾病[1]，其病因复杂，现代医学关于该病的病因多从遗传、感染、精神、代谢障碍以及免疫异常等方面论述[12]，而免疫功能紊乱在银屑病中的作用越来越受到人们的关注。既往研究认为，Th1/Th2比例失衡是导致银屑病发生的重要因素[2]，但近年来新发现一种CD4+T细胞Th17亚群及其相关细胞因子在银屑病中所发挥的作用引起人们的重视[3-4]。原始T细胞在TGF-β和树突状细胞(CD细胞)分泌IL-6的诱导下向原始Th17细胞分化，IL-23则在其后期分化成熟和维持其稳定过程中发挥重要作用。成熟以后的Th17细胞分泌IL-23和IL-17，IL-23正反馈促进Th17细胞的分化成熟[5-6]，而IL-17与其相应的受体结合可激活p38MAPK[7]。p38MAPK在银屑病患者非皮损区及正常人表皮中主要表达于胞浆，而在银屑病患者皮损处被磷酸化激活后转移细胞核内活化多种核转录因子和其他激酶，继而上调IL-6的表达[13]，进一步诱导原始T细胞向Th17亚群分化。此外，IL-17还可以通过上调IL-8的表达诱导大量炎性细胞在银屑病皮损处聚集，引起角质形成细胞的过度增殖，促进皮损的发生[8]，说明p38MAPK/IL-17信号通路在银屑病发生发展中起至关重要的作用。

中医药对银屑病的治疗具有注重整体观念、辨证施治、副作用小等特点，尚有一定的优势。中医学对银屑病早有“松皮癣、干癣”的记载。情志不畅，而肝失疏泄，“五脏有病，则各传其所胜”，木旺克土引起土衰，土衰则制水不及而至水盛。脾升胃降，有赖于肝之疏泄，而肝失疏泄则可使脾失健运、水湿内生、郁而化热、湿热蕴于肌表而为病。此类患者皮疹潮红或有糜烂，皮屑多而黏厚，瘙痒无度，兼有胁痛口苦目眩、小便黄赤、饮食不振、脘痞等症状。故选用《医方集解》之龙胆泻肝汤为基础方，在此基础上去木通加以金银花、土茯苓，其中以龙胆草上清肝经实火、下泻肝经湿热，金银花清热解毒共为君药，泽泻、车前子助龙胆草下泻肝胆湿热，黄芩、土茯苓助金银花清热解毒，白芍、当归养血而柔肝，诸药共用可清肝之实火，泻肝之湿热，健脾除湿而消疹。通过现代药理分析表明，龙胆泻肝汤加减方具有很多有效成分，作用较为广泛，主要体现在抗病原微生物、抗炎、调节免疫、抑制表皮细胞增生、止痒、调节代谢障碍以及保肝、利尿等方面[9]。

本研究发现，银屑病患者皮损处p38MAPK基因与患者外周血中Th17相关细胞因子表达水平明显增高，其增高程度与患者PASI评分密切相关，说明三者之间相互影响，在银屑病发生发展以及患者皮损形成过程中起到极其重要的作用。经龙胆泻肝汤加减方治疗后，患者外周血5种细胞因子的表达水平有所下降，同时患者PASI评分也显著降低，与对照组比较差异有统计学意义，说明龙胆泻肝汤加减治疗银屑病临床疗效显著，值得推广。基于以上研究基础，可以考虑将银屑病患者皮损处p38MAPK基因以及外周血中Th17相关细胞因子的检测作为临床评估银屑病严重程度及患者预后的检测指标。

本实验不足之处只是单纯检测治疗前P38MAPK蛋白的表达，因临床条件及皮损取材所限，无法对银屑病患者治疗后皮损P38MAPK蛋白表达的检测。在下一步的研究中，希望能通过动物实验明确龙胆泻肝汤加减方治疗银屑病的作用机制。

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