RTN4在胃癌发病机制中的作用

张超　周业　谢黎明

摘 要：目的 了解RTN4蛋白在胃癌發病过程中的作用，为揭示胃癌发病的分子机制提供实验资料。方法 将pIRESneo3-RTN4真核表达载体转染胃粘膜上皮GES1细胞，建立RTN4高表达的GES1-RTN4细胞系；通过细胞生长曲线、平皿克隆与软琼脂集落形成实验、流式细胞仪，观察RTN4高表达对GES1细胞生长与增殖、周期与凋亡的影响；利用Western-blot检测GES1-RTN4细胞中IκBα蛋白的表达。结果 GES1-RTN4细胞的生长速度较GES1和GES1-pIRESneo3细胞加快，统计学意义显著（P<0.01）；GES1-RTN4细胞较GES1和GES1-pIRESneo3细胞克隆体积大、数目多，统计学意义显著（P<0.01）；GES1-RTN4细胞中S期细胞比例较GES1和GES1-pIRESneo3细胞增加，细胞增殖指数增加，细胞凋亡率降低，统计学意义显著（P<0.01）；GES1-RTN4细胞中IκBα蛋白表达较GES1和GES1-pIRESneo3细胞减少，统计学意义显著（P<0.01）。结论 RTN4通过活化NF-κB信号通路，提高细胞增殖指数，抑制细胞凋亡，促进GES1细胞的增殖。

关键词：GES1细胞；RTN4蛋白；细胞增殖；NF-κB信号通路

中图分类号：R735.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.016

文章编号：1006-1959（2018）22-0055-05

The Role of RTN4 in the Pathogenesis of Gastric Carcinoma

ZHANG Chao1，2，ZHOU Ye1，XIE Li-min3，HE Xiu-sheng1，ZHANG Zhi-wei1

（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology，Cancer Research Institute，School of Medicine，Nanhua University，Hengyang 421001，Hunan，China；

2.Department of Dermatology，Nanhua Hospital，Nanhua University，Hengyang 421001，Hunan，China；

3.the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，Hunan，China）

Abstract： Objective To investigate the role of RTN4 protein in the pathogenesis of gastric carcinoma and to provide experimental data for revealing the molecular mechanism of gastric carcinoma.Methods The pIRESneo3-RTN4 eukaryotic expression vector was transfected into gastric mucosal epithelial GES1 cells to establish a high expression of GES1-RTN4 cell line. The cell growth curve， plate clone and soft agar colony formation assay， flow cytometry， high RTN4 expression were observed. The effects of GES1 cell growth and proliferation， cycle and apoptosis were detected by Western-blot. The expression of IκBα protein in GES1-RTN4 cells was detected by Western-blot. Results The growth rate of GES1-RTN4 cells was faster than that of GES1 and GES1-pIRESneo3 cells， which was statistically significant（P<0.01）. The GES1-RTN4 cells were larger and more numerous than GES1 and GES1-pIRESneo3 cells，the statistical significance was significant（P<0.01）； the proportion of S phase cells in GES1-RTN4 cells was higher than that of GES1 and GES1-pIRESneo3 cells， the cell proliferation index increased， and the apoptosis rate decreased， statistically significant（P<0.01）；The expression of IκBα protein in GES1-RTN4 cells was significantly lower than that in GES1 and GES1-pIRESneo3 cells，statistically significant（P<0.01）. Conclusion RTN4 can increase the cell proliferation index， inhibit cell apoptosis and promote the proliferation of GES1 cells by activating NF-κB signaling pathway.

Key words：GES1 cells；RTN4 protein；Cell proliferation；NF-κB signaling pathway

胃癌（gastric carcinoma，GC）是我国常见的十大恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率居第2位，消化道肿瘤的第1位[1，2]。现今，胃癌在我国的发病率呈现逐年下降与年轻化的趋势，但仍然严重危害人们健康与生命[3]，其发病的分子机制仍不十分清楚。本课题组前期采用定量蛋白质组学技术鉴定了243个胃癌相关蛋白质，发现RTN4蛋白在胃粘膜癌变过程中表达上调[4]，但其在胃癌发病过程中的具体作用及机制仍不清楚，深入了解其在胃癌发病中的作用，将为阐明胃癌发病的分子机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系和质粒 永生化胃粘膜上皮GES1细胞购自上海中国医学科学院细胞生物研究所，用10%小牛血清的RPMI 1640培养基常规培养。pIRESneo3-RTN4真核表达载体购自长沙佳和生物科技有限公司。

1.1.2引物 根据RTN4基因序列，采用Premier 6.0软件设计重组RTN4和β-actin内对照引物，由上海英骏生物技术有限公司合成RTN4引物（5'-AAAGATATCAAATATGGACTTGAA-3'；5-AAAGGATCCCTGACCCTCCC CCGTA-3'，大小2961 bp）与β-actin引物（5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3'；5'-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3'，大小498 bp）

1.1.3主要试剂 高保真酶、T4 DNA Ligand merase、Reverse transcription system试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，限制性内切酶HindIII和XhoI购自 Fermentas公司，一抗与二抗购自Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1细胞免疫荧光 将细胞以每孔3×105个接种于6孔板中，制作细胞爬片，固定、PBS洗涤，1∶1000鼠抗人RTN4单抗37 ℃孵育1 h，PBS洗涤，1∶2000 FITC标记羊抗鼠二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗涤，封片后荧光显微镜下观察。

1.2.2 Western-blot检测 收集细胞，提取总蛋白质测定浓度，10%不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温孵育封闭，1∶1000鼠抗人RTN4或IκBα单抗与1∶2000抗β-actin单抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，1∶1000辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜，发光、曝光、显影与定影。扫描蛋白质条带灰度分析，细胞中RTN4或IκBα蛋白的表达。

1.2.3 MTT比色法 将细胞以每孔5×103个接种于96孔板中，每组设3个平行孔，培养24 h，每孔加入5 mg/μl MTT 20 μl，培养4 h，每孔加入150 μl DMSO，溶解后置于酶标仪中，测定每孔的吸光度值（OD值），重复检测细胞1次/d，每次重复3次，取平均值，将每次测量值与第1的测量值之商进行校正，代表检测细胞生长的测量值，连续重复7 d，将校正测量值绘制于坐标纸上，绘制细的生长曲线。

1.2.4平皿克隆形成实验 将细胞以每孔1000个细胞接种于6孔板中，每组设3平行孔，静置培养1周后，固定、结晶紫染色，肉眼计数细胞形成的克隆数，或显微镜下计数>50个细胞的克隆数，计算克隆形成率：克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.2.5软琼脂集落形成实验 制备终浓度0.6%底层琼脂，冷却后；制备终浓度0.3 %顶层琼脂（含细胞 1×104个/孔），铺于底层琼脂上，每组细胞设3个平行孔，连续培养2周后。显微镜下观察集落（≥50个细胞为1个集落）的数目和大小，每组随机选择10个不同的低倍视野，计数集落数，重复计数3次，取平均值，计算细胞集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。

1.2.6流式细胞仪（FCM）检测 收集细胞，调整密度为1×106 个/μl，4 ℃，70 %乙醇固定，PBS洗涤，含RNA酶Tris-HCl液37 ℃孵育30 min，加入50 mg/L碘化丙锭染色，送公司进行流式细胞仪检测，分析细胞周期与细胞的凋亡率，计算细胞增殖指数（PI）=（S+G2）/（G0/G1+S+G2）。

1.3统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，两组均数比较采用t检验，组间比较采用q检验，三组以上比较采用单因素方差分析（One way ANOVA），以P<0.01表示统计学意义顯著。

2结果

2.1建立RTN4高表达的GES1细胞系 将pIRESneo3-RTN4质粒（pIRESneo3为对照载体）转染GES1细胞，G418筛选后，建立RTN4稳定高表达GES1细胞（GES1-RTN4），免疫荧光与Western-blot检测RTN4表达，结果显示GES1-RTN4细胞中RTN4蛋白表达水平升高，见图1、图2。

2.2 RTN4高表达对GES1细胞生长的影响 采用MTT法检测GES1-RTN4细胞的生长情况。结果显示，GES1-RTN4细胞的生长速度显著快于GES1和GES1-pIRESneo3细胞，见图3。提示RTN4高表达后GES1细胞生长加快，增殖能力增强。

2.3 RTN4高表达对GES1细胞克隆形成的影响 平皿克隆实验结果显示，GES1-RTN4细胞形成的克隆数多，克隆形成率明显高于GES1和GES1-pIRESneo3细胞（P<0.01），见表1。提示RTN4高表达后，GES1细胞增殖能力增强。

2.4 RTN4高表达对GES1细胞集落形成的影响 软琼脂形成集落实验结果显示，GES1-RTN4细胞形成的集落较GES1和GES1-pIRESneo3细胞大，数目多，集落形成率高（P<0.01），见表2。说明RTN4高表达后，GES1细胞增殖能力增强。

2.5 RTN4高表达对GES1细胞周期分布的影响 流式细胞仪检测结果显示，GES1-RTN4细胞群中G0/G1期较GES1和GES1-pIRESneo3细胞减少，而S期则增加，细胞增殖指数增高（P<0.01），见表3。说明RTN4高表达后，提高GES1细胞增殖指数而促进细胞的增殖。

2.6 RTN4高表达对GES1细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，GES1-RTN4细胞的凋亡率（17.52±1.23）低于GES1（24.65±4.58）和GES1-pIRESneo3（24.43±3.36）细胞（P<0.01）。说明RTN4高表达后抑制GES1细胞的凋亡。

2.7 Western blot检测RTN4高表达对NF-κB信号通路的影响 GES1-RTN4细胞中IκBα蛋白的表达明显低于GES1和GES1-pIRESneo3细胞（P<0.01），见图4。说明RTN4高表达后可以诱导GES1细胞中NF-κB信号通路的活化。

3讨论

胃癌的发生与遗传因素密不可分，涉及癌基因的激活与抑癌基因的失活[5]，如C-met基因、K-sam基因、C-erbB2基因、K-ras基因、C-myc基因、p53基因、p27 基因和p16基因等。分子遗传学变化与病理学特征、胃癌生物学行为及患者预后间关系十分密切。了解相关基因调节分子的机制，可为阐明胃癌的发病机理，临床诊断与治疗等提供十分有利证据。

RTN4蛋白在中枢神经系统、胰腺、肾脏、骨骼肌、肺、肝与胃肠道等组织广泛表达。有研究证实在肝癌组织中，低氧可诱导RTN4高表达，促进血管生成，加速瘤体生长[6]。缺氧微环境能够促进缺氧诱导因子HIF-lα和AP-1因子产生，促血管生成因子RTN4表达增加，导致肿瘤组织血管生成，加速肿瘤生长[7]。也有研究证实RTN4在胃癌组织中呈现高表达，其表达较癌旁对照组织明显升高，结果提示该蛋白在肿瘤中可能发挥促进肿瘤细胞增殖的作用[8]。本研究发现RTN4 高表达后，GES1细胞的增殖能力增加，增殖指数升高，细胞凋亡率降低，提示其可能具有一定的促进细胞恶变的功能。

核因子κB（NF-κB）信号通路在细胞中作用重要，控制调节增殖、细胞凋亡逃避和血管生成等，其活性受IκBs抑制蛋白调节[9，10]。NF-κB与IκBs蛋白相互结合后遮蔽核转位信号区，NF-κB位于细胞内不能入核，抑制其转录活性[11]。IκBα是IκBS中研究最多者，其在细胞内通过快速磷酸化或降解后，使NF-κB分离后入核，发挥转录活性，调节相关基因的表达[12]。本文发现RTN4蛋白在GES1细胞中高表达后，细胞增殖能力增强，且IκBα蛋白表达降低，提示RTN4在GES1细胞内可能通过促进NF-κB信号通路活化，抑制细胞凋亡，提高细胞增殖指数，诱导细胞增殖。因细胞内NF-κB信号通路调节机制复杂，RTN4如何具体参与NF-κB信号通路的活化仍有待深入研究。

综上所述，本文初步发现RTN4高表达后可促进GES1细胞增殖，抑制细胞凋亡，其可能启动了NF-κB信号通路的活化，为进一步研究RTN4在GES1細胞增殖中的作用及机制提供了思路，也为阐明胃癌发病的分子机制提供了理论依据。

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收稿日期：2018-8-20；修回日期：2018-9-7

编辑/肖婷婷