陕西佛坪木蹄层孔菌的挥发性成分及生物活性

2018-03-05解修超路宏朝陈文强邓百万

江苏农业科学 2018年1期

解修超，罗强，路宏朝，陈文强，邓百万

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723001；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中 723001)

木蹄层孔菌(Fomesfomentarius)别称火绒层孔菌，为担子菌门(Basidiomycete)伞菌纲(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyaceae)层孔菌属(Fomes)真菌，是世界性分布的木腐性真菌。在18、19世纪，曾被用来作为止血的膏药，在传统的药典中被用来与针灸搭配治疗疾病；其药用部位为子实体，粗提物具有抗肿瘤、抗氧化、利尿、退烧、消积化、消炎止痛等作用，已经被应用于传统药物的生产。

近年来，陆勇芹等研究发现，木蹄层孔菌乙醇提取物对肿瘤细胞具有很强的抑制作用[1-2]。研究表明，不同提取方法所获得的提取物组分具有部分差异，其中报道过的化学成分包括有机酸、多糖、内酯、苷类、植物甾醇和萜类化合物等[3]。刘量等用乙醇提取木蹄层孔菌子实体所得的提取物对S180腹腔积液瘤、人肺癌细胞NCI-H 460和人胃癌细胞SGC-7901均有较明显的抑制效果[2，4]。陆勇芹等用石油醚等提取木蹄层孔菌所得的提取物对Hela、H22荷瘤、人肺癌(NCI-H 460)和胃腺癌(SGC-7901)等细胞株均具有较强的抑制效果[1，3，5]。高慧灵等研究木蹄层孔菌中多糖对小鼠免疫功能的影响，结果表明，木蹄多糖可促进小鼠免疫细胞分泌细胞因子，增强小鼠的体液免疫功能及巨噬细胞的吞噬功能[6-7]。

本研究以陕西佛坪木蹄层孔菌为材料，通过索氏提取及气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer，简称GC-MS)技术，分析子实体中挥发性物质的化学成分，并对挥发性物质的抑菌和抗肿瘤活性进行研究，以期为陕西佛坪木蹄层孔菌资源的开发与利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 木蹄层孔菌木蹄层孔菌子实体样品(图1)采自陕西佛坪自然保护区，该自然保护区位于秦岭中段南坡(33°43′40″N，107°46′05″E)。

1.1.2 靶标菌株和肿瘤细胞株大肠埃希菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供；肺癌肿瘤细胞株A549，由陕西理工大学维生素D生理与应用研究所提供。

1.1.3 仪器与试剂气相色谱-质谱联用仪(GS6890N/MSD5973N型，美国安捷伦科技有限公司)，高级研究显微镜(E600型，日本Nikon公司)，二氧化碳培养箱(Thermo3110型，美国Thermo公司)，酶标分析仪(TECAN infinite 200 PRO型，瑞士TECAN公司)，倒置生物显微镜[徕卡DMIL/DFC450，德国徕卡(Leica)公司]，数显式恒温培养箱(LRH-250-GS 型，广东省医疗器械厂)；所用抗生素(青霉素和氯霉素)购自美国MP Biomedicals公司，分析纯试剂(乙醚，二甲基亚砜等)购自天津市科密欧化学试剂有限公司，培养基所需试剂购自陕西西安热默尔生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 挥发性成分提取将木蹄层孔菌子实体置于40 ℃烘箱中恒温干燥48 h，干燥至恒质量，粉碎过40目筛备用。称取样品40.0 g，用滤纸包裹后置于索氏提取器中，加入 300 mL 乙醚，加热至40 ℃恒温，回流提取 8 h，相同温度回收乙醚，得挥发油样品。

1.2.2 GC-MS检测采用氢氧化钾-甲醇酯化法对样品进行处理，得到GC-MS检测用样[3，8]。GC-MS的检测条件：美国J & W HP-5弹性石英毛细管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，程序升温(以5 ℃/min的速率由50 ℃升至 240 ℃，恒温保持2 min，进样口温度200 ℃)，GC气化室温度为 250 ℃，载气为99.99%高纯度氦气，流速为2.0 mL/min。质谱条件：离子源为电子电离源(electron ionization，简称EI)，电子轰击能量70 eV，离子源温度230 ℃。倍增电压 1.28 kV，质量扫描范围为m/z10～550，扫描速度3.8次/s[9-10]。检测结果在美国NIST11.lib 标准质谱图库检索确认其成分，得到总离子流图，运用峰面积归一化法并借助G170LBA化学工作站数据处理系统处理数据。

1.2.3 生物活性检测

1.2.3.1 抑菌活性检测采用滤纸片扩散法[10]测定样品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抑制作用。取适量挥发性物质原液，分别配制成质量浓度为200.0、100.0、50.0 g/L的样品溶液，分别加入适量过氧化氢酶消除可能带来的活性影响。将直径为6.0 mm的无菌滤纸片置于各浓度样品上清液中浸湿，贴在涂有30.0 μL靶标菌悬液(菌悬液密度为0.8×106～1.2×106CFU/mL)的LB培养基平板上，对照组分别为无菌水、1%苯扎溴铵溶液、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，简称DMSO)、青霉素和氯霉素，37 ℃ 恒温培养24 h后，观察并采用十字交叉测量法记录抑菌圈直径，测量各质量浓度样品在不同靶标菌平板上的抑菌圈直径。处理平行组、对照组分别设5个重复。

1.2.3.2 抗肿瘤活性检测采用CCK-8法[11]测定样品的抗肿瘤活性。取对数期肺癌肿瘤细胞株A549，经过血球计数板计数后使细胞液密度达到5×104个/mL，然后接入96孔板中，每孔接100 μL (肿瘤细胞数约5 000个/孔)，取相应质量组分挥发油样品用滤头过滤除菌，分别溶于适量二甲基亚砜中(最终DMSO的质量分数<1%)[12]，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基充分稀释溶解药物，作为试验组样品。37 ℃培养24 h使细胞贴壁，试验组每孔各加入含相应质量浓度挥发性物质的培养液200.0 μL，5孔重复，样品挥发油设5个倍比质量浓度梯度，分别为32.0、64.0、128.0、256.0、512.0 mg/L，以含1% DMSO的等量培养基作空白对照，其他操作步骤均与试验组相同。37℃继续培养，分别在培养24、48 h时置于显微镜下观察肺癌肿瘤细胞株A549的生长情况。48 h 后向每孔中加入CCK-8试剂10.0 μL，继续同温培养1～8 h，用酶标分析仪检测加入CCK-8试剂后1、2、4、8 h各孔在 450 nm 处的吸光度。按以下公式计算各浓度挥发油对肿瘤细胞株A549的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率=(1-试验组D450 nm/空白对照组D450 nm)×100%。

采用SPSS 19.0软件进行曲线拟合，最终得半数抑制率所需挥发油质量浓度IC50。

2 结果与分析

2.1 挥发性成分的提取

取样品40.00 g，以乙醚作为溶剂，采用索氏提取法回流提取12 h，得到具有特殊香味的红褐色透明状挥发油 2.33 g，经计算得率为5.83%。

2.2 挥发性成分的化学组成与分析

对木蹄层孔菌的挥发性成分进行GC-MS检测，得样品中挥发性成分的相对含量，结果如表1所示。由表1可知，经多重比对共检测出7种主要化学成分，占总挥发性成分的99.99%，主要成分为酞酸二乙酯(37.82%)、十八烷醛(32.83%)、壬醛(11.98%)、9(11)-脱氢麦角酰苯甲酸酯(9.87%)，此4种成分占总检测挥发油成分的92.50%。

表1 木蹄层孔菌挥发性成分的化学组成与含量

2.3 木蹄层孔菌挥发性成分的生物活性

2.3.1 抑菌活性以4种细菌作为靶标菌，对挥发性成分进行抑菌活性研究。试验结果(表2)表明，各质量浓度挥发油表现出不同程度的抑菌活性。由表2可知，木蹄层孔菌挥发油对4种靶标细菌抑制活性均较弱，不同质量浓度的抑菌效果具有一定剂量-效应依赖关系。其中挥发油质量浓度为200.0 g/L时，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达10.27 mm，对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌表现较弱的抑制活性。

2.3.2 抗肿瘤活性将加入相应质量浓度挥发油的肿瘤细胞置于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养，分别在培养24、48 h 时观察肿瘤细胞的生长状况，结果如图2至图5所示。由图2至图5可知，试验组在培养24 h后，肿瘤细胞数量与同期空白对照相比明显减少，形态相对皱缩，部分细胞裂解；48 h时相对数量继续减少，大部分细胞出现裂解现象；空白对照组中的肿瘤细胞在48 h内数量持续增加，形态近椭圆状，贴壁生长，易聚集成群。经显微观察，试验组与对照组的5孔平行重复同一时期未见明显差异。

表2 木蹄层孔菌挥发性成分对4种靶标菌的抑菌情况

注：表中数据为5个平行组的平均数值；滤纸片直径为 6.00 mm；0为未产生抑菌圈；1 000单位/mg青霉素用无菌水稀释，1 000 单位/mg氯霉素用DMSO稀释，浓度均为25.0 mg/mL。

通过CCK-8法测定不同浓度挥发油对肺癌肿瘤细胞株A549的抗肿瘤活性，在 450 nm处测量样品的吸光度。试验结果(图6)表明，提取物对肺癌肿瘤细胞株A549的抑制率与样品浓度之间呈剂量-效应依赖关系，对照组加入CCK-8试剂4 h后的吸光度为2.683。

由图6可知，木蹄层孔菌挥发性成分可明显抑制肺癌肿瘤细胞株A549的生长，并且随着样品浓度升高，对肺癌肿瘤细胞株A549的抑制效应升高，抑制率最高达76.73%。其中随着添加量倍比的增高，抑制效应的相应强度明显上升，较高浓度时抑制率的增长逐渐变缓。由挥发油浓度与肺癌肿瘤细胞株A549抑制率之间的量效关系生成的对数拟合曲线计算得到IC50=268.675 mg/L。

3 讨论

本研究利用GC-MS技术分析并检测陕西佛坪木蹄层孔菌中7种挥发性成分，结果显示，主要为酯类和醛类，并且7种有效成分的总含量占总挥发性成分的99.99%，其中含量超过2.00%的化学成分有5种，占全部鉴定成分的96.50%，且大部分挥发性成分在其他研究中尚见未报道，如杜德尧等用石油醚、乙醇、甲醇和三氯甲烷等提取试剂时[3，5]，均未获得本研究所检测到的部分有效成分，并且酞酸二乙酯、壬醛、9(11)-脱氢麦角酰苯甲酸酯在木蹄层孔菌成分分析中属首次获得。笔者分析这可能与木蹄层孔菌寄生树种、生长条件和提取试剂等有关。

笔者对陕西佛坪木蹄层孔菌的挥发性成分进行抑菌及抗肿瘤活性研究。试验结果表明，挥发油样品对供试4种靶标菌中的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌抑制活性较弱，对金黄色葡萄球菌抑菌效果较强。在抗肿瘤活性检测中，样品对肺癌肿瘤细胞株A549显示较高的抗肿瘤活性。经细胞形态跟踪观察发现，48 h内挥发油对肿瘤细胞生长的抑制作用表现稳定并持续增加；另外，随着样品浓度的倍比增加，肿瘤细胞的抑制率与样品浓度之间呈剂量-效应依赖关系，IC50为 268.675 mg/L。本研究采用 CCK-8 法进行细胞增殖检验，避免使用准确度不高、易出现假阳性和步骤繁琐等缺点的MTT法，同时，万文婷等报道CCK-8法检验细胞增殖效果较MTT法更佳[13]。因此，排除了部分假阳性的干扰，使研究结果更加准确可靠。木蹄层孔菌的挥发性成分主要为酯类和醛类等，有较好的抗肿瘤活性和一定的抑菌活性，可为陕西佛坪木蹄层孔菌资源的开发与综合利用提供一定的理论指导，而关于本研究挥发油中的抑菌有效成分、最低拮抗浓度及抑菌机制还有待进一步探究。

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