FSH和LH及其受体基因在梅山猪公猪HPT轴的表达

产舒恒，陈子璇，张戌园，陈 青，王宵燕

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009)

动物体内的促性腺激素包括垂体前叶分泌的卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)、胎盘分泌的孕马血清促性腺激素和绒毛膜促性腺激素以及垂体前叶和胎盘分泌的促乳素。其中，FSH、LH及其相关基因是动物生长发育过程中重要的生理功能基因。在雄性动物中，FSH促进睾丸足细胞合成和分泌雄激素，刺激生精上皮的发育和精子发生(在次级精母细胞及其以前的阶段，FSH起重要作用，此后由睾酮起主要作用)。LH刺激睾丸间质细胞合成和分泌睾酮，促进副性腺的发育和精子最后成熟[1]。

FSH是一种糖蛋白激素，分子是由非共价键结合的α和β 2个亚单位组成的异质二聚体。在同一物种中，α亚基是一致的，而β亚基是特异性的[2]。一般认为α亚基负责信号的转化作用，β亚基是功能亚基[3]，参与受体的结合。现在认为，α、β亚基均参加受体的结合与信号的转导作用。LH也是一种糖蛋白激素，它的分子结构与FSH的分子结构相似，由α和β 2个亚单位组成，α亚基为促性腺激素所共有，β亚基具有激素和种间特异性，是激素的特异性亚基单位，能与靶器官受体结合。目前，对FSH-β亚基和LH-β亚基的研究较多，如赵要风等对猪FSH-β亚基基因的研究表明，FSHβ基因在几个猪品种之间存在多态性，而且是作为一种促进卵泡发育和成熟的糖蛋白激素，高排卵数猪品种二花脸、梅山猪与其他低排卵数品种表现出对应的差异[3]。对于FSH和LH的作用，传统观点认为FSH、LH只对性腺有作用，但是近年来的研究发现，在性腺外的组织上也存在这2种激素受体，王亚男对京海黄鸡FSHβ和FSHR基因的表达规律的研究结果显示，FSHR基因在脾脏中的表达量仅次于性腺[4]，说明FSH、LH在性腺外组织中也可能起作用，李波等对母猪性腺外FSH受体和LH受体表达的研究也证明了这一点[5]。关于FSH和LH在动物体中的发育性表达研究进展迅速，倪迎冬等研究了出雏至性成熟绍鸭卵巢FSHR和LHR表达的变化，结果显示卵巢FSHR mRNA水平呈先升后降趋势，LHR mRNA水平的变化，总体呈逐渐升高趋势[6]。郝建明等论证了垂体前叶存在着LH、FSH、LH-FSH等3种促性腺激素细胞，为进一步探讨FSH、LH分泌及基因表达与调控，揭示生殖生理规律提供了新的资料和思路[7]。近年来，基因工程重组FSH和LH的研究逐步发展，使人们可根据一些特殊需求改造天然FSH和LH的结构和功能，使之具有更高的活性、更稳定的结构，以满足畜牧生产和医学应用的需要。同时，也为其他糖蛋白激素基因工程制剂的研制生产提供借鉴[8]。

本试验采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法和荧光定量(PCR)方法分析FSH和LH在梅山猪公猪脑组织、生殖组织和内脏组织中的表达特征及表达规律，确定FSH和LH在不同发育阶段中的表达量以及它们在细胞中的定位，这将有助于更好地了解它们在精子发生过程中的作用和对睾丸功能的调节。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验动物梅山猪由江苏省苏太猪育种中心提供。取6头150日龄的梅山猪公猪睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾、精囊腺、前列腺、尿道球腺、大脑、小脑、下丘脑、垂体、海马、心、肝、脾、肺、胃及肌肉等组织用于表达谱分析。将2(n=6)、30(n=6)、60(n=5)、90(n=5)和150日龄(n=6)的梅山猪在屠宰后取下丘脑、垂体、右侧睾丸用于基因的发育性表达研究。

1.2 试剂与仪器

试剂：液氮、TRIzol[宝生物工程(大连)有限公司]、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、DEPC水(Fermentas)、超纯水、Oligo(dT)18(Fermentas)、5×反应缓冲液(Fermentas)、Ribonuclease Inhibitor(Fermentas，20 U/μL)、dNTP(Fermentas 10 mmol/L)、M-MuLV Reverse Transcriptase(Fermentas，200 U/μL)、10×buffer[宝生物工程(大连)有限公司]、4×dNTP[宝生物工程(大连)有限公司，2.5 mmol/L]、Taq酶[宝生物工程(大连)有限公司，5 U/μL]、引物(上海英维捷基生物工程有限公司)、琼脂糖(MBI Fermentas)、5×TAE水、Marker(TaKaRa公司)、荧光定量试剂盒。

试验器材：研钵、研磨棒、匀浆器、4 ℃离心机、指形管、紫外分光光度仪、PCR管、水浴锅、普通离心机、超净工作台、PCR仪、烘箱、电泳仪和紫外成像仪、荧光定量PCR仪。

1.3 组织样品RNA的提取与反转录

1.3.1 样品RNA的提取与浓度测定 采用酚-三氯甲烷-异戊醇的方法提取组织RNA。提取的RNA用一定量的DNAase(RNAase free)消化，测D260 nm/280 nm，采用电泳法检测RNA纯度。严格定量后，取5 μg组织总RNA利用反转录酶进行反转录合成cDNA。

1.3.2 反转录与半定量检测目的基因的表达 取RNA样品5 μg，按照试剂盒的要求进行反转录，引物序列等信息见表1。目标基因PCR体系(25 μL)：超纯水17.3 μL；10×buffer 2.5 μL；4×dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL；rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL；上游引物(F端)1 μL；下游引物(R端)1 μL；模板DNA 1 μL。目标基因PCR程序：预变性94 ℃ 4 min；真变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，循环数为35次。琼脂糖电泳检测并拍照分析。

表1 检测目标基因表达情况所用引物序列等信息

1.4 荧光定量

以2、30、60、90及150日龄梅山猪下丘脑、垂体和睾丸为模板研究FSH和LH发育性表达变化。20 μL反应体系：Mixture 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA样品 50 ng，加水至20 μL。样品在96孔板混匀后放入ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，每个样本设3个重复。反应程序参照SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)说明书。

定量PCR的数据采用2-ΔΔCT分析。CT值由ABI7500的软件自动分析。以β-actin为内参，150日龄组作对照，ΔΔCT=(CT目的基因-CT管家基因)1、30、60、90日龄组-(CT目的基因-CT管家基因)150日龄组。2-ΔΔCT表示2、30、60、90日龄组目的基因的表达量相对于150日龄的变化倍数。

1.5 数据统计

应用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析对FSH、LH及其受体在不同日龄的公猪HPT轴相关组织中的表达进行差异比较。

2 结果与分析

2.1 FSH和LH及其受体在公猪脑组织、生殖组织和内脏组织中的表达特征

2.1.1 FSH及其受体在公猪脑组织、生殖组织和内脏组织中的表达特征 由图1可见，FSHβ基因只在梅山猪公猪的下丘脑和垂体中表达，在垂体中表达丰度较高，在下丘脑中较低；FSHR基因在梅山猪公猪的睾丸、在附体、附尾和尿道球腺中表达，在睾丸中表达丰度较低，在附体、附尾和尿道球腺中的表达丰度基本一致。

2.1.2 LH及其受体在公猪脑组织、生殖组织和内脏组织中的表达特征LHβ基因在梅山猪公猪的睾丸、附头、附体、垂体、大脑、小脑和海马中表达，在小脑中的表达丰度较低；LHR基因在梅山猪公猪的睾丸和下丘脑中表达，表达丰度基本相同(图2)。

2.2 FSH和LH及其受体在不同日龄的公猪HPT轴相关组织中的表达

2.2.1 FSH及其受体在下丘脑、垂体和睾丸中的相对表达量 由表2可知，FSHβ在下丘脑和垂体中的相对表达量在一定范围内随日龄的增加而增加，90日龄表达量开始上升，150日龄达到表达高峰，FSHβ在下丘脑中的表达量在前4个日龄段中无显著差异，150日龄的表达量与前4个日龄段存在显著差异(P<0.05)，FSHβ在垂体中的表达量在90日龄时显著高于前3个日龄段，而150日龄的表达量与前4个日龄段有显著差异(P<0.05)；FSHR在睾丸中的相对表达量在前3个日龄段中较稳定，90日龄时表达量开始降低，150日龄达到最低值，90日龄、150日龄与前3个日龄段相比存在显著差异(P<0.05)。

2.2.2 LH及其受体在下丘脑、垂体和睾丸中的相对表达量 由表3可知，LHβ在垂体中的表达、LHR在下丘脑中的表达和LHR在睾丸组织中的表达趋势相同，呈现波动起伏状态，30日龄出现表达高峰，60日龄表达量降低，90日龄时再次达到表达高峰后又降低，并且30、90日龄的表达量与其余3个日龄段的表达量多数呈现显著差异(P<0.05)；LHβ在睾丸中的表达量在前3个日龄段无显著差异(P<0.05)，90日龄时达到表达量最高峰，其表达量与其他4个日龄段呈现显著差异(P<0.05)，150日龄时表达量有所降低。

表2 FSHβ及其受体在下丘脑、垂体和睾丸中的相对表达量

注：同一行含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

表3 LH及其受体在垂体、下丘脑和睾丸中的相对表达量

3 讨论

3.1 FSH和LH在公猪各个组织中的表达特征

一直以来，人们普遍认为FSHR、LHR仅存在于特异的性腺的靶器官和组织中，近年来研究发现，FSHR、LHR可存在于性腺外组织[9]。本试验结果显示，FSHβ、LHβ和LHR在脑组织中有表达，说明FSH和LH及其受体并不是特异性地表达在性腺组织中，根据本试验结果，笔者推测脑组织参与和调控性激素的合成和代谢过程，FSH、LH也可能对脑组织的某些功能起调节作用。此外，FSHβ在下丘脑和垂体中均有表达，但在垂体中的表达量高于下丘脑中的，可能因为FSHβ在垂体中的调节作用大于在下丘脑中的调节作用。精子细胞是在睾丸中生成，在附睾中发育成熟的[10]。FSHR在睾丸和附睾中均有表达，但在睾丸中的表达量比较低，说明FSH结合FSHR可能在精子发生和成熟方面都有调控作用，但其对精子发育具有主要调控作用；LHβ在睾丸和附睾中的表达量基本相同，则其可能在精子发生和发育过程中都发挥重要作用；LHR只在睾丸中表达，那么它可能对精子发生过程起重要的调控作用。有研究表明，FSH对雄性动物可刺激精子的发生，它能刺激曲细精管上皮和次级精母细胞的发育，在LH和雄激素的协同下使精子发育成熟。但是如果只增加FSH的量，虽能使睾丸增大、曲细精管上皮细胞分裂活动增加、精子细胞增多，但并无成熟精子形成[11]。这一研究结果为本试验的推测提供了重要依据。

3.2 FSH和LH在各日龄的下丘脑、垂体和睾丸中的表达规律

陈雪雁等研究FSH和LH在不同发育阶段(4、6、9周)大鼠睾丸中的表达，结果显示在mRNA水平，在不同发育阶段中FSH的表达无明显差别，而LH只在6周和9周的大鼠中有表达[12]。位兰等研究黄体生成素在不同日龄(1、30、90日龄)雏鸵鸟睾丸内的分布发现，1 d鸵鸟睾丸内有分布，但在30 d睾丸内未检测到；LH在90 d鸵鸟睾丸内有分布，但其阳性表达较弱[13]。Grzegorzewska等在鸡胚发育的第11天和第17天的FSH和LH表达研究中发现，在不同性别中FSH和LH的表达具有明显差异[14]。上述几项研究只选取了2个或3个发育阶段，而本试验选取了梅山猪生长过程的5个日龄段(2、30、60、90、150日龄)。从试验结果来看，FSHβ在下丘脑和垂体中的表达量总体呈现上升的趋势，90日龄的表达量迅速升高，150日龄最高；LHβ在垂体中的表达、LHR在下丘脑中的表达和LHR在睾丸组织中的表达趋势相同，呈现波动起伏状态，30日龄出现第1次表达高峰，90日龄时又达到第2次表达高峰，出现这种情况的原因可能与梅山猪公猪在30日龄开始精子发生过程和60～90日龄间到达初情期密切相关；FSHR在睾丸中的表达量与LHβ在睾丸中的表达量都呈现先升高后降低的趋势，不同的是在FSHR在30日龄时表达量最高，LHβ在90日龄时表达量最高，而30日龄是精原干细胞启动精子发生的时期，60～90日龄是公猪的初情期启动阶段，这一试验结果证实公猪体内促性腺激素对精子发生和初情期的启动具有调控作用。

4 结论

4.1 FSH和LH在公猪各个组织中的表达特征

FSHβ基因在梅山猪公猪的下丘脑和垂体中表达，FSHR基因在梅山猪公猪的睾丸、附体、附尾和尿道球腺中表达，LHβ基因在梅山猪公猪的睾丸、附头、附体、垂体、大脑、小脑和海马中表达，LHR基因在梅山猪公猪的睾丸和下丘脑中表达。

4.2 FSH和LH在各日龄的下丘脑、垂体和睾丸中的表达规律

FSHβ在下丘脑和垂体中的表达总体呈现上升的趋势，LHβ在垂体中的表达、LHR在下丘脑中的表达和LHR在睾丸组织中的表达趋势相同，呈现波动起伏状态，30日龄出现第1次表达高峰，90日龄时又达到第2次表达高峰，FSHR在睾丸中的表达与LHβ在睾丸中的表达都呈现先升高后降低的趋势。

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