金针菇菌株遗传多样性的RAPD分析

李 红，李 超，张 敏

(辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳 110161)

金针菇[Flammulinavelutipes(Fr.)Singer.]隶属于真菌门担子菌亚门层菌纲无隔担子菌亚纲伞菌目口蘑科小火焰菌属，因形似金针菜而得名。金针菇是古今中外著名的食用菌之一，金针菇蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，具有抗癌功能，经常食用具有预防高血压、治疗肝病和胃溃疡等功效。金针菇特别以富含赖氨酸而著称，可以活化神经细胞，促进智力发育，素有“增智菇”之美称，是当今市场上十分走俏的天然保健食品之一。随着金针菇产业的迅速发展，金针菇新品种选育已成为食用菌育种研究的重要内容之一，为此，开展金针菇菌株的遗传多样性分析及了解菌株间遗传差异就具有重要意义。

随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，简称RAPD)标记以基因组DNA为模板，以1个随机的寡核苷酸序列(通常为10个碱基对)作引物，通过PCR扩增反应，产生不连续的DNA产物，用以检测DNA序列的多态性。它具有程序简单、DNA用量少、随机引物没有严格的种属界限、不须要事先知道基因组的任何分子信息就能快速检测大量遗传多态性等优点。在食用菌领域常用于品种鉴定、遗传关系分析、分子遗传的构建及基因定位等研究。Khush等用RAPD技术分析双孢蘑菇的野生和栽培品种，在8个异核体中识别出7个不同的基因型。说明RAPD标记在遗传研究中的通用性和对菌株指纹识别的有效性[1]。Zhang等用RAPD标记对15个香菇菌株行分析，其中13个菌株的DNA指纹各异，2个菌株谱带一致，说明RAPD标记可用于鉴别香菇菌种，并可用于香菇育种和菌种改良[2]。詹才新等以金针菇不同亲本菌株及其杂交种为材料进行RAPD分析后，认为RAPD技术可鉴别出真伪杂种[3]。Castle等曾以RFLP为标记进行双孢蘑菇及大肥菇种内和种间多态性研究。王翠等应用RAPD技术对滇西北地区冬虫夏草、阔孢虫草和蛹虫草进行遗传分化研究，表明虫草群体中存在着显著的地区差异性[4]。本研究应用RAPD-PCR分子标记的方法对金针菇菌株遗传多样性进行分析，以期为金针菇资源遗传多样性及遗传育种亲本的选配提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

各供试菌株的具体情况见表1。

表1 供试菌株

1.2 培养基

PDB综合培养基：马铃薯400 g，葡萄糖40 g，磷酸二氢钾 6 g，硫酸镁3 g，蛋白胨6 g，水2 000 mL，pH值自然。用于总DNA提取的菌丝培养。

1.3 试剂和仪器

RAPD-PCR反应所用的TaqDNA Polymerase、dNTP、10×buffer、Mg2+购自北京鼎国昌盛公司，DNA marker(DL2000)、引物购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR仪为德国Biometra公司Thermocycler。

1.4 引物

各引物的具体情况见表2。

1.5 试验时间和地点

试验于2017年3月在辽宁省农业科学院食用菌研究所进行。

表2 22个引物序列

1.6 菌丝体培养

将活化的菌丝切下0.5 cm2菌块，接种于PDB综合培养基，23 ℃摇床培养，转速为150 r/min。将培养好的菌液用无菌水洗涤2次，用无菌滤纸汲干菌丝体表面的水分，-20 ℃保存备用。

1.7 总DNA提取及检测

采用改良的CTAB法提取基因组总DNA，0.1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。

1.8 引物筛选

引物筛选是进行RAPD分析的一个关键环节。用来筛选引物的模板采用4个具有典型性状、亲缘关系较远的材料，这样筛出的引物才具有代表性，RAPD-PCR扩增出的结果多态性较高且可能每份供试材料都能扩增出丰富的多态性位点。

引物参照NY/T 1743—2009《食用菌菌种真实性鉴定 RAPD法》公布的22条引物序列，由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.9 PCR反应及电泳

PCR反应体系(25 μL)：模板DNA 200 ng/uL，dNTPs 200 μmol/L，引物0.4 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.5 U，Mg2+2.5 mmol/L，10×buffer 2.5 μL，用ddH2O补至总体积25 μL。

扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，Tm退火1 min(退火温度因不同引物而定)，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用GelDoc-It型凝胶成像系统照相。

1.10 数据处理

电泳结果采取0/1赋值记带，将在琼脂糖凝胶上出现DNA片段的记为1，不出现的记为0，将统计形成的“0-1”数据表输入DPSv6.55版数据统计分析软件中，采用Jaccard聚类距离采用类平均法(UPGMA)进行“0-1”聚类分析，并计算遗传相似度。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取

由图1可以看出，每一样品在电泳时均形成明显的1条整齐带，并且条带比较亮，无弥散的荧光区出现，说明DNA样品没有降解。用CTAB法提取的DNA色泽近白色或无色。说明大多数酚类、多糖、蛋白质等物质已被较彻底去除，纯度比较高。

2.2 引物筛选

从22条引物中筛选出8条多态性丰富、谱带清晰且重复性好的引物，分别为S15、S9、S6、S16、S18、S10、S4、S11，如图2所示。

2.3 PCR反应

利用筛选出来的8条引物对35个供试菌株进行RAPD-PCR扩增，共扩增出68条条带(图3、图4、图5)，其中多态性条带为56条，多态位点率为82%。每条引物扩增出约9条条带，DNA片段大小为500～2 000 bp。

2.4 基于RAPD分析结果构建树状图

如图6所示，35个菌株间的遗传相异系数变化范围在 0～0.71 之间。当遗传相异系数为0.60时，供试菌株被聚类成5个类群：第1类为BJ-11、BJ-12、BJ-13、日白金、韩金、珍玉8、411、白金2、千曲、白金48、913、白金1、恒生金、白金16、高产2、FV80、金851、白金3、金新美15、F21、纯白68、特丰6、寿光5、金1312、韩金51、白金8、白金10，全部为白色品种；第2类为黄金5032、川金3、738；第3类为金玉22；第4类为406、黄金55；第5类为金19、金43。第2、第3、第4、第5类都是黄色金针菇品种，说明RAPD分析结果与菌株农艺性状结果趋同。

3 结论与讨论

食用菌菌种、菌株的质量好坏直接关系到食用菌产业能否良性发展。目前食用菌市场缺乏统一管理，菌种管理混乱，菌种退化、老化，品种混杂，同种异名、同名异种等问题严重。分子标记技术为这一难题提供了快速、准确的鉴定手段，可以快速、灵敏、准确地用于食用菌的菌种、菌株鉴定。

选择杂交亲本是食用菌杂交育种中最为重要的一个环节之一。一直以来，育种工作者都是通过形态学分析测试来鉴定和选择亲本。这种方法耗时费力，鉴定结果也易受环境干扰。随着分子生物学技术的发展，在分子水平上进行亲本菌株的选择势在必行[5]。

本研究应用RAPD-PCR分子标记的方法对金针菇菌株遗传多样性进行分析，从22条引物中筛选出8条多态性丰富、谱带清晰且重复性好的引物进行RAPD-PCR扩增。结果显示，8条引物均能将供试菌株区分开，表明RAPD分子标记对金针菇菌株遗传多样性分析是可行的，并能把白色金针菇和黄色金针菇区分开来，与菌株农艺性状结果趋同。

但是，RAPD-PCR分子标记技术也有缺点，即稳定性和重复性不好，为了克服这些缺点，下一步的工作将开发由RAPD标记转化的特定序列扩增(SCAR，sequence characterized amplified region)标记，相对于RAPD标记[6]，SCAR标记所用引物较长且引物序列与模板DNA完全互补，可在严谨条件下进行扩增，因此结果稳定性好、可重复性强[7-8]，用SCAR标记分析金针菇种质资源更可靠。

[1]Khush R S，Becker E，Wach M.DNA amplification polymorphisms of the cultivated mushroomAgaricusbisporus[J].Applied and Environmental Microbiology，1992，58(9)：2971-2977.

[2]Zhang Y，Moilina F L.Strain typing oflentinulaedodesby random amplified polymorphic DNA assay[J].FEMS Microbiology Letters，1995，131(1)：17-20.

[3]詹才新，朱兰宝.RAPD技术在金针菇杂交育种中的应用[J].食用菌学报，1995，2(1)：7-11.

[4]王 翠，谢宝贵，陈梁军，等.金针菇菌株的SCAR标记分子鉴别[J].福建农业学报，2013，28(10)：966-970.

[5]李 博.金针菇遗传连锁图的构建及菌丝生长速度的QTL定位[D].福州：福建农林大学，2009：30-37.

[6]庞瑞华，王 玲，李小宁，等.信阳地区水稻资源的遗传多样性分析[J].江苏农业科学，2016，44(7)：113-116.

[7]傅 冰.SCAR标记在地木耳菌株分类鉴定中的运用[J].江苏农业科学，2016，44(9)：64-66，74.

[8]刘靖宇，宋秀高，叶 夏，等.香菇菌株遗传多样性ISSR，RAPD和SRAP综合分析[J].食用菌学报，2011，18(3)：1-8.