胶体金免疫层析法测定水产品中孔雀石绿药物残留的方法探索

王玉梅

1.材料与方法

1.1 原理

样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。

1.2 仪器

移液器：200μL、1mL和5mL

涡旋混合器

离心机：转速 ≥4000r/min

电子天平：感量分别为0.01mg 和0.01g

氮吹浓缩仪

恒温水浴锅

1.3 试剂盒

四年来，一直用的是无锡中德伯尔生物技术有限公司的孔雀石绿快速检测试剂盒，开展检测前，先任意抽取3个检测卡进行性能验证，验证检测卡是否有效。

1.4 孔雀石绿质控加标液的配制

配制孔雀石绿（无色）标准溶液，浓度为2.0μg/mL，溶剂：乙腈，存放于4℃冰箱，避光保存（有效期1年）。

1.5 检测流程和方法

检测方法参照试剂盒里的使用说明书

阴性结果：T线比C线深或一样深，表示样本中孔雀石绿浓度低于其检测限；

阳性结果：T线比C线浅，表示样本中孔雀石绿浓度高于其检测限

1.6 检测条件

检测条件见表1。

2.检测结果与讨论

2.1 检测结果见表2

2.2 讨论

表1 检测条件

2.2.1 样品前处理一定要认真。样品要求新鲜，取脂肪含量较低部位的肌肉，比如鱼，要求去皮、去骨，去脂肪，只取背上的一部分肉；虾要去头、去壳，取虾仁，肉取好后要充分粉碎成肉糜状，否则肉的颗粒太大，在检测时，与试剂接触的面较小，不能充分提取、氧化，最后可能会出现假阴性。我们曾做了对照试验，对同一样品采取不同的样品处置方法，一个是肉糜状，一个加工粗糙，有骨头，鱼肉用剪刀剪后，没有充分粉碎，颗粒较大，在样品中直接添加浓度为3.0μg/kg孔雀石绿标准溶液进行检测，结果会出现假阴性。

2.2.2 样品复溶再离心后一定要等明显分层后取下层液体用于检测，因为如果有违禁药物的残留，在经过一系列的处理后，会溶解在下层液体中，取上层液体就会检测不出或出现假阴性的情况。

2.2.3 做检测前必须对本批次的速测盒进行性能验证，至少抽3个检测卡用于性能验证，检测本批次的速测盒是否有效，是否能检测出阳性。以免有的速测盒因为存放时间长、保管措施不到位而影响了速测盒的性能。

表2 2013-2016年孔雀石绿检测结果

2.2.4 注意检测时间要求，在样本提取完后要求在10分钟内进行检测，待检样品溶液在酶标孔中完全溶解，等待反应时间10分钟，最后判读检测卡反应的时间5～8分钟，所有的检测要求在规定时间内完成。

2.2.5 出现假阳性的原因。2013年以来，共有5个样品检测结果疑似阳性，后来把疑似阳性的留样送至省水产品质量检测中心重新定量检测，只有1个是阳性，其余是阴性。其原因可能是两个方面：一是出现了交叉反应，可能试剂盒里的抗原抗体的特异性太差；二是样品里含有与孔雀石绿分子结构差不多的物质，该物质与试剂盒内的抗原抗体先发生反应而出现假阳性的现象。

（通联：226500，江苏省如皋市如城镇解放路动植物检测中心三楼）