生防菌对杧果主要病害病原菌室内抑菌试验

张贺，杨石有，汪熊梦琦，刘晓妹，漆艳香，蒲金基

(1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；2.海南大学热带农林学院，海南 海口 570228)

杧果种植过程中常遭受多种病害，如刺盘孢属Colletotrichumspp.真菌引起的杧果炭疽病，链格孢属Alternariaspp.真菌引起的杧果链格孢叶斑病，以及由镰孢属Fusariumspp.真菌引起的且在金沙江干热河谷暴发成灾的杧果畸形病[1-4]，这些病害不同程度地威胁着杧果健康生长[5]。施用农药是防治病害的重要措施，随着杧果种植面积逐年扩大，病害防治难度加大，化学农药使用量总体呈上升趋势。过量使用农药不仅增加生产成本，也影响杧果质量安全和生态环境安全。实现农药减量控害，是当前杧果病害防治的难题之一。

以菌治菌是植物病害防治的重要方法之一，前人在此方面的研究也取得了积极进展[6-9]。为筛选对杧果重要病害有良好防效的生防菌，作者用前期得到的生防菌和市售的生防菌剂，采用平板对峙培养法测定其对刺盘孢属、链格孢属、镰孢属等27株病菌菌株的室内抑菌效果，以期初步获得对杧果单一病害或多种病害均有良好防效的生防菌，为杧果病害的生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试病菌菌株 刺盘孢属8株，编号为2K120cg、2K345cg、A1、bca、Lcg1、mac9、Mcg、Tai；链格孢属9株，菌株编号为A108、A157、A406、A452、A456、A466、A483-1、A92、A93；镰孢属10株，菌株编号为FM4、MMD1、MMD12、MMD14、MMD17、MMD20、MMD27、MMD29、MMD30、MMD4。27株病菌菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组提供，每个属的病菌菌株均分离自病害发生严重的海南省三亚市、乐东县、东方市，云南省保山市，广西壮族自治区百色市，四川省攀枝花市等杧果主产区。

1.1.2 供试生防菌剂 枯草芽孢杆菌S1，山东省梁山县阳光生物工程研究所；枯草芽孢杆菌S2，北海群林生物工程有限公司；枯草芽孢杆菌S3，云南星耀生物制品厂；嗜冷·枯草·纳豆芽孢杆菌S4，山东宝来利生物工程股份有限公司；侧孢芽孢杆菌S5，河南省沃宝生物科技有限公司；巨大芽孢杆菌S6，河南省沃宝生物科技有限公司；地衣芽孢杆菌S7，临沂十七狼饲料有限公司；蜡质芽孢杆菌S8，山东泰洛药液有限公司；枯草·纳豆·地衣芽孢杆菌·硝化细菌S9，西安富祺生物科技有限公司；市售的生防菌剂地衣芽孢杆菌S10，山西凯盛肥业集团有限公司；解淀粉芽孢杆菌S11，山西凯盛肥业集团有限公司。

1.1.3 供试生防菌 生防酵母菌JM由实验室筛选而得；枯草芽孢杆菌5a-9、6a-3、6c-5、6c-5、FCK、B1和Z10由海南大学刘晓妹教授提供。

1.2 试验方法

1.2.1 病菌培养和生防菌菌悬液制备 刺盘孢属、链格孢属和镰孢属病菌接种在PDA平板上，28 ℃培养4 d之后，用无菌打孔器在菌落边缘打直径5 mm菌饼，用于接种LB平板(直径9 cm)的正中央备用。

将市售11种生防菌剂依有效成分含量用LB培养液系列稀释至浓度为2×107个/mL的菌悬液，6种生防芽孢杆菌(编号为5a-9、6a-3、6c-5、FCK、B1、Z10)和1株生防酵母菌JM接种于LB培养液中，28 ℃、120 r/min 恒温摇培24 h后，系列稀释法配置成菌体浓度为2×107个/mL的菌悬液备用。

1.2.2 生防菌抑菌作用检测 采用平板对峙培养法。LB平板中央接种靶标病菌，同时在其夹角呈90°的四周、间距靶标病菌3.0 cm处接种2.5 μL生防菌液，28 ℃恒温培养3 d后测定病菌菌落直径、抑菌带宽度，并根据尹敬芳 等[10]人的方法计算生长抑菌率，每个处理3个重复。

1.2.3 数据分析 采用Excel 2003统计数据、计算生长抑菌率，SAS数据处理系统运用邓肯新复极差法进行方差分析，运用HemI 1.0.3.3软件以抑菌率绘制直观可视化的热图，展示不同生防菌对不同病菌的抑菌效果，每个小方格表示一个生防菌对一个病菌菌株的抑菌效果，用行表示不同病菌、用列表示不同生防菌，红色表示抑菌率高，绿色表示抑菌率低，综合分析不同病菌与不同生防菌之间抑菌效果差异[11]。

2 结果与分析

2.1 生防菌对刺盘孢属病菌菌丝生长的拮抗作用 供试的生防菌对刺盘孢属的8个菌株有明显的抑菌效果，平均抑菌率为17.27%～36.77%。生防菌剂枯草芽孢杆菌S3显著强于其他的生防菌，其平均抑菌率为36.77%；其次为巨大芽孢杆菌S6和枯草芽孢杆菌FCK，平均抑菌率分别为27.59%和25.96%，二者差异不显著(表1)。

表1 生防菌对木亡果主要病原菌抑菌率 %

注：根据Duncan’s多重比较，同列不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示组间差异不显著(P>0.05)。

生防菌剂枯草芽孢杆菌S3对供试的8个菌株均有较强的抑菌效果，其中对Mcg菌株的抑菌效果最强，抑菌率53.79%，抑菌带1.03 cm；多个生防菌菌株对bca菌株有较强抑菌效果(图1)。

注：以抑菌率作热图，红色表示抑菌率高，绿色表示抑菌率低。图1 生防菌对刺盘孢属病菌菌丝生长抑菌率

2.2 生防菌对链格孢属病菌菌丝生长的拮抗作用 供试的生防菌对链格孢属的9个菌株有明显的抑菌效果，平均抑菌率为9.77%～28.63%。其中枯草芽孢杆菌6a-3效果最好，平均抑菌率28.63%；其次为枯草芽孢杆菌S3和FCK，平均抑菌率分别为24.55%和24.48%，二者差异不显著(表1)。病菌株A483-1对供试的11种市售生防菌剂和7种前期筛选得到的生防菌均有很强耐受性，部分生防菌株对其还有促生长作用；枯草芽孢杆菌B1对病菌菌株A108抑菌效果最强，抑菌率达50.64%，抑菌带1.60 cm(图2)。

注：以抑菌率作热图，红色表示抑菌率高，绿色表示抑菌率低。图2 生防菌对链格孢属病菌菌丝生长抑菌率

2.3 生防菌对镰孢属病菌菌丝生长的拮抗作用 供试的生防菌对镰孢属的10个菌株抑菌效果明显，平均抑菌率为15.35%～50.95%。枯草芽孢杆菌S3显著强于其他的生防菌，平均抑菌率50.95%；其次为枯草芽孢杆菌FCK抑菌率为40.37%；蜡质芽孢杆菌S8抑菌效果较差(表1)。枯草芽孢杆菌S3对9个菌株有很好的抑菌效果，抑菌率为45.69%～60.07%、平均抑菌带宽为1.10 cm；病菌MMD1菌株对枯草芽孢杆菌S3、枯草·纳豆·地衣芽孢杆菌·硝化细菌S9、枯草芽孢杆菌5a-9、6c-5、FCK、B1和Z10较敏感，而病菌MMD29菌株则对多个生防菌株的敏感性较差(图3)。

注：以抑菌率作热图，红色表示抑菌率高，绿色表示抑菌率低。图3 生防菌对镰孢属病菌菌丝生长抑菌率

3 结论与讨论

供试的7株生防菌和11种市售生防菌剂对杧果上分离的27株病菌的抑菌结果表明，枯草芽孢杆菌S3对刺盘孢属、链格孢属、镰孢属病菌都有明显的抑菌效果，尤其对镰孢属病菌的抑菌效果最好，平均抑菌率超过50%，而对链格孢属病菌的抑菌效果则略次。与市售的商品化生防菌剂相比，本次筛选的枯草芽孢杆菌FCK菌株的抑菌效果与生防菌剂S3有较好抑菌效果，具有开发成生防菌剂的潜力，可用于杧果病害的生物防治。

芽孢杆菌Bacillusspp.是广泛存在于自然界中重要的生物防治微生物资源，芽孢杆菌对植物病原真菌的拮抗作用已被前人证实[8]，是杧果病害绿色防控技术中的重要生防菌。平板对峙培养中2种菌落在培养基上竞争能力的高低，以最终形成的抑菌圈直径大小为标准，从试验结果来看，其与病原菌间主要有营养竞争和产生抑菌物质抑制病菌菌丝的生长两种情况，这与关一鸣 等[12]的研究结果较为相似。芽孢杆菌的生防机制主要有营养物质与空间位点竞争、抗菌物质分泌及溶菌、促进植物生长等[13]。部分供试病菌的菌丝受生防菌的影响明显膨大、畸形，阻碍了菌丝的正常生长。陈莉[14]认为芽孢杆菌能够分泌多肽，从而起到抑菌作用；韩玲 等[15]在枯草芽孢杆菌菌液对百合枯萎病的防治的研究过程中认为芽孢杆菌能产生制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，对作物的多种真菌病害有防治作用。生防菌剂芽孢杆菌类枯草芽孢杆菌S3、巨大芽孢杆菌S6、枯草芽孢杆菌FCK和酵母菌菌株JM在本试验中对多种杧果上病菌的抑菌率较高，与康浩 等[16]、刘晓妹 等[17]研究结果相似，可用于下一步的田间病害防治试验。

试验中同一种病害的不同病菌菌株对生防菌的耐受性差别明显，有些菌株对生防菌剂十分敏感，而有些菌株则对生防菌剂耐性较高，不同生防菌剂的抑菌效果也差异明显。因此在开展生防菌筛选时应考虑到两个方面，一方面是在不同病害发生区域内选取多个菌株用于生防菌的筛选与鉴定，另一方面是选取多种无相互拮抗的生防菌，复配成多种生防菌剂的混合液进行筛选，再结合田间试验获得高效的、广谱、易于培养的生防菌剂，应用于病害防治，减少化学农药的使用量，延缓病菌的抗药性产生，降低化学农药对环境的威胁，从而保证杧果的优质高产。