小鼠Bcl2a1a蛋白的生物信息学预测分析

杨筱舟，杨渊，李明阳，马春霞，陈元鼎

中国医学科学院&北京协和医学院 医学生物学研究所，云南 昆明 650118

B细胞淋巴瘤因子2（BCL2）是重要的细胞凋亡调节因子，其主要功能是控制内源性凋亡途径中线粒体细胞色素C的释放[1-2]。BCL2包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，以多种方式相互作用诱导或抑制线粒体膜外孔的形成[3-6]。由于在凋亡机制中起关键作用，BCL2蛋白常在癌细胞中失调。因此，许多BCL2抗凋亡蛋白基因被确定为重要的细胞内致癌基因，成为抗癌治疗的靶点。

BCL2相关蛋白A1（BCL2A1）主要在造血系统中表达，并通过螯合促凋亡BCL2蛋白发挥其抗凋亡功能。然而，若BCL2A1在多种癌细胞，包括血液恶性肿瘤和实体瘤中过度表达，则可能促进肿瘤发展[7]。

BCL2A1的转录受高度调节，可被粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖和肿瘤坏死因子诱导产生[8-10]，并被鉴定为NF-κB的靶基因[11]。BCL2A1在CD40信号通路中可上调B淋巴细胞存活率[12-14]，也可通过PI3K和ERK信号通路诱导表达。BCL2A1也受翻译后水平调控，如泛素/蛋白酶体途径的调控、组成型蛋白酶体介导的周转，最终导致蛋白质的半衰期缩短[15-16]。

研究表明，人BCL2A1mRNA广泛分布于肺、小肠、睾丸和平滑肌细胞，而可能由于表达模式的差异，小鼠Bcl2a1mRNA几乎只在造血细胞中表达[10]。小鼠Bcl2a1包含4个拷贝，即A1-a、A1-b、A1-c和 A1-d。A1-a、A1-b、A1-d几乎相同，A1-c含有导致截短转录物的点突变[17]。总的来说，鼠和人的BCL2A1蛋白具有72%的氨基酸同一性及非常相似的结构[18-19]。我们以小鼠Bcl2a1中的A1-a为对象，进行一系列生物信息学预测。

1 材料与方法

1.1 材料

登录NCBI，在GenBank数据库（https://www.nc⁃bi.nlm.nih.gov/gene/）中搜索小鼠（MUS）Bcl2a1a基因，获得其全长基因序列（Gene ID：12044）和氨基酸序列（NP_033872.1）；再搜索人类（HOMO）BCL2A1基因，获得其全长基因序列（Gene ID：597）和氨基酸序列（NP_004040.1），并保存为FASTA格式。

1.2 方法

用NCBI中的BLASTN（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）基因序列对比工具对人类BCL2A1基因和小鼠的Bcl2a1a基因进行比对，获得同源区段。用启动子在线分析软件Promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）、Network Promoter Predic⁃tion（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）对小鼠Bcl2a1a基因的启动子进行预测。用MerhPrimer CpG Island Prediction（http://www.uro⁃gene.org/cgi-bin/methpeimer/methprimer.cgi）预 测 小鼠Bcl2a1a基因中的CpG岛分布情况。用Prot⁃Param（http://web.expasy.org/protparam/）分 析 小 鼠Bcl2a1a蛋白的理化性质，包括相对分子质量、分子式、理论等电点、不稳定系数、脂肪系数、总平均疏水指数等。用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析小鼠Bcl2a1a蛋白的疏水性。用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白质跨膜区域。用Signal P（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信号肽。登陆ExPASy网站，利用SOPMA工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测Bcl2a1a蛋白的二级结构。用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）进行保守结构域搜索。登陆SMART网站，输入Bcl2a1a氨基酸序列，分析其功能域和相互作用网络。用PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）分析跨膜螺旋区域、二硫桥及结合位点等性质。用Swiss_model（http://swissmodel.expasy.org/interactive）在线软件预测分析Bcl2a1a蛋白的三级结构。

2 结果

2.1 小鼠Bcl2a1a基因序列分析

小鼠Bcl2a1a基因长5497 bp，位于9号染色体，包含2个编码区，分别位于132～551和5253～5351 bp，可编码172个氨基酸残基。

人源BCL2A1蛋白有2种异构体，此处以第一种异构体来与小鼠Bcl2a1a进行基因序列对比，发现两者的同源区域在≥200 bp处。

2.2 小鼠Bcl2a1a基因启动子预测结果

2种软件对Bcl2a1a基因启动子的预测结果有所差异，Network Promoter Prediction测出小鼠Bcl2a1a的启动子区域有2个，最高分区域为3493～3543 bp。Promoter 2.0测出的鼠源Bcl2a1a启动子区域有3个，最可能的位点是4600 bp。结果见表1。对Bcl2a1a基因进行CpG岛预测，结果如图2，没有预测到CpG岛的存在，所以本次启动子预测结果准确率较低。

2.3 小鼠Bcl2a1a蛋白一级结构预测结果

通过ProtParam预测小鼠Bcl2a1a蛋白的理化性质，结果见表2。该蛋白不含色氨酸残基，序列的N端可能是甘氨酸残基。

2.3.1 Bcl2a1a蛋白亲疏水性分析 用ProtScale计算蛋白质亲疏水性分布图，用Hphob/Kyte&Doo⁃little标度，如图3所示。横坐标表示氨基酸位置，纵坐标表示标度得分，＜0表示亲水，＞0表示疏水。可以明显看出疏水性峰值多于亲水性峰值，由此推测此蛋白为疏水性蛋白，不溶于水。各个氨基酸残基打分分值见表3。

图1 人类BCL2A1与小鼠Bcl2a1a基因的同源区段

图2 小鼠Bcl2a1a基因CpG岛分布

表1 Bcl2a1a基因启动子预测

表2 Bcl2a1a理化性质分析表

图3 Bcl2a1a蛋白氨基酸序列亲水性与疏水性预测

2.3.2 跨膜区结构预测与信号肽分析 蛋白质如果具有跨膜功能，则它在膜内可以与膜脂结合，并被运输到膜外。蛋白与膜脂结合的部分即为跨膜区域。图4A为利用TMHMM跨膜螺旋预测算法得到的Bcl2a1a跨膜区域预测结果。红色细线为跨膜区域，可知Bcl2a1a跨膜区域基本为零，说明该蛋白不是跨膜蛋白。但是此软件的阴性结果并不十分可信，因而继续检测其信号肽来推测该蛋白是否可以分泌到胞外行使功能。信号肽一般在蛋白质N端，极少超过45个氨基酸残基。本次使用的神经网络法结果主要涉及3个值，C值代表信号肽酶切位点值，S值代表信号肽区域值，Y值为综合考虑C值和Y值所得参数，其比单独考虑C值要更加精确。如图4B所示，软件预测结果显示mean S在1～33位点，值为0.123，小于分泌型蛋白的标准值0.5。再结合TMHMM的结果，可知Bcl2a1a为胞内蛋白而非分泌型蛋白，须裂解细胞后才可以收集。

表3 氨基酸分值表

2.4 蛋白二级结构预测分析

用SOPMA工具预测Bcl2a1a蛋白的二级结构，结果如图5，最长的蓝色竖线为α螺旋，红色竖线为延伸链，绿色竖线为β转角，最短的紫色竖线为无规则卷曲。Bcl2a1a蛋白的氨基酸序列由55.81%的α螺旋、18.60%的无规卷曲、17.44%的延伸链和8.14%的β转角构成。α螺旋为Bcl2a1a蛋白的主要折叠形式。

图4 Bcl2a1a跨膜区（A）和信号肽（B）预测

图5 Bcl2a1a蛋白的二级结构

2.4.1 模体预测 模体属于蛋白的二级结构，表示蛋白中具有特定空间构象和特定功能的结构成分。用NCBI的Conserved Domain Search Ser⁃vice（CD Search）软件，输入 Bcl2a1a的氨基酸序列，获得该蛋白的模体预测结果（图6），包含BH1、BH2、BH3区域，与细胞凋亡规律有关。

2.4.2 结构域与蛋白相互作用网络 利用Smart软件预测的Bcl2a1a蛋白结构域和相互作用网络结果如图7所示。该蛋白37～140位氨基酸残基对应于一个BCL结构域；该蛋白与Bbc3、Apaf1、Bcl2l2、Trp53、Bak1、Bid、Nfkb1、Jun、Rel、Rela等蛋白形成相互作用网络。

图6 模体结构

图7 Bcl2a1a蛋白的功能域预测（A）和相互作用分析（B）

图8 预测Bcl2a1a蛋白信息

2.4.3 蛋白信息预测 如图8所示，菱形为蛋白结合位点，红色方框表示存在螺旋区域，橘黄色圆圈为多核苷酸结合位点，紫色方框为裸露部分，黄色方框为隐藏部分，绿色方框为无序区域，蓝色条带为结合TrEMBL位点，绿色条带为结合Swiss-prot位点，红色条带为结合PDB位点。该蛋白存在11个蛋白结合位点，1个多核苷酸结合位点，含大量螺旋区域。

2.5 蛋白三级结构预测

用Swiss-model构建Bcl2a1a蛋白的三级结构模型。利用同源建模方法，以Bcl2a1、细胞凋亡调节因子BAX及Bcl-2-like protein 2作为建模的模板，最终得到的Bcl2a1a蛋白三级结构如图9所示，其中包含大量α螺旋，少量无规卷曲、延伸链和β转角。预测结果与用SOPMA软件预测的蛋白二级结构性质吻合。

3 讨论

小鼠Bcl2a1a和人类BCL2A1基因的同源区域为≥200 bp处，小鼠Bcl2a1a基因最可能的启动子区域是3493～3543和4600 bp。Bcl2a1a蛋白的理论相对分子质量为460 087.23，理论等电点为4.76，脂肪系数为31.00，半衰期为30 h，不稳定系数44.43大于40，说明蛋白不稳定，总平均疏水性0.712大于0，预测为疏水性蛋白，所以该蛋白是一种不稳定的疏水性蛋白。二级结构预测表明Bcl2a1a蛋白无信号肽，无跨膜区域，存在11个蛋白结合位点，1个多核苷酸结合位点，含大量螺旋区域，α螺旋为主要折叠形式。运用同源建模法，使用在线建模软件Swiss-model构建Bcl2a1a蛋白的三级结构模型，表明该蛋白含有1个BCL结构域，且与一些蛋白形成相互作用网络。

图9 Bcl2a1a蛋白的三级结构预测

细胞凋亡是生物细胞主动消亡的程序性活动，是多细胞机体调节机体生长发育、调控细胞衰老、稳定内环境的重要机制。细胞凋亡过程被精细准确地调控。作为BCL-2蛋白家族的一员，BCL2A1可以减少线粒体释放促肿瘤细胞色素C，从而抑制细胞凋亡。BCL2A1与许多疾病有关，比如在慢性淋巴细胞白血病中，BCL2A1高表达与病情严重程度有关，表明BCL2A1在同质人群中与病情预后有关[20]；此外，BCL2A1在Mantle细胞淋巴瘤及各种大B细胞淋巴瘤中高表达。除了在血液系统异常表达外，BCL2A1 mRNA在实体肿瘤中也过度表达，如乳腺癌，已发现断奶后怀孕小鼠中Bcl2a1 mRNA上调，通过阻止细胞凋亡来阻止乳腺退化[21]；如胃肠癌，与正常组织相比，BCL2A1 mRNA在胃癌中过表达，表明BCL2A1也可能在实体瘤中发挥作用[22]；另外还有肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌[23]和黑色素瘤[24]，其中乳腺癌样本中检测到BCL2A1 mRNA的最高表达[25]。

在实际应用中，BCL2A1抑制剂可用于癌症治疗，因其抗凋亡功能，BCL-2蛋白已被确定为抗癌治疗的靶标。目前，几种BCL-2蛋白的小分子抑制剂正进行多种恶性肿瘤（包括慢性淋巴细胞性白血病）临床试验。尽管BCL2A1在许多不同类型的癌症中过表达，但通过小分子抑制剂对BCL2A1进行抑制是开发抗癌治疗剂的新希望。

本研究由小鼠Bcl2a1a基因序列出发，对其蛋白的二、三级结构进行预测，得到了相关的理化性质和基本特征。因为和人类BCL2A1为同源基因，所以以小鼠为模型进行上述疾病的研究是一种很好的选择。本实验为该基因以及相关疾病的进一步研究提供了参考，然而运用生物信息学研究基因和蛋白并不能保证结果完全准确，仍然需要实际实验操作完成。

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