八仙花叶柄离体培养和植株再生技术研究

2018-03-03杨宝明黄玉玲李永平张艺萍王丽花

山西农业科学 2018年2期

杨宝明，苏艳，黄玉玲，李永平，张艺萍，桂敏，王丽花

（1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南昆明 650205；2.云南省农业科学院花卉研究所，农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明），国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明 650205）

八仙花（Hydrangea macrophylla）又名绣球花、紫阳花，为虎耳草科八仙花属植物。花大而美，花序呈球形，开花时节，花团锦簇，其花色能红能蓝，令人悦目怡神，是常见的盆栽观赏花木，也是主要的鲜切花。八仙花原产我国四川和日本，在亚洲主要是日本盛产，主要作为家庭盆栽观赏。其花色随土壤pH的变化而变化，在花蕾期施用硫酸铝可使花颜色形成蓝色，施用石灰可使花保持粉红色[1]。我国栽培八仙花的时间较早，在明、清时代建造的江南园林中就栽有八仙花，现代公园和风景区都成片种植，已形成景观[2-3]。八鲜花传统的繁殖方法为扦插、分株和压条等，繁殖速度慢，不能满足市场对种苗的需求，而植物组培技术可在短时间内建立无性繁殖体系，不受外界条件和季节影响，生长周期短，可控性强，可实现周年生产，能稳定地为市场提供性状稳定、品质统一的优良种苗[4-9]。有关八仙花组织培养的研究报道较多，但大部分都以茎段[5-18]、茎尖[19]或叶片[20]为繁殖材料，而以叶柄作为外植体的研究报道[21]很少。

本试验以八仙花叶柄为繁殖材料，通过分析比较不同激素浓度配比对外植体愈伤组织诱导、分化以及植株再生的影响，以筛选适宜的愈伤组织诱导培养基、不定芽增殖培养基和生根培养基，旨在为八仙花的组织培养提供一种新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

取八仙花植物当年生枝条上的中部和上部叶柄（包括叶片）作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 外植体的灭菌在自来水下将外植体冲冼干净，用0.2%的高锰酸钾溶液浸泡15 min，用自来水冲洗干净，剪去叶片，留下叶柄。在超净工作台上先用75%的酒精浸泡20 s，再用0.1%的升汞灭菌12 min，然后用无菌水冲洗5～6次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

1.2.2 愈伤组织的诱导培养经灭菌的叶柄，用手术刀切长为0.5 cm左右的小块，接种于1～16号处理的培养基中，平放置于培养基表面，30 d后统计出愈率及生长情况，并进行转接。每个处理接种10瓶，每瓶接种1块外植体，重复3次。

1.2.3 不定芽的分化培养经愈伤组织诱导培养获得的愈伤组织，切割成0.5 cm×0.5 cm的方块，接种于17～24号处理的培养基中，20 d后统计不定芽分化率、芽丛数量和生长情况。每个处理接种10瓶，每瓶接种1块愈伤组织，重复3次。

1.2.4 增殖培养经不定芽诱导培养获得的小苗或者芽丛，分割为含1～2个茎节的茎段或含有2～3个小芽的芽丛，转接到25～28号处理的培养基中，15 d后统计芽增殖率及生长情况。每15 d为一个转接周期。每处理接种5瓶，每瓶接种6个茎段或芽丛，重复3次。

1.2.5 生根培养经增殖培养获得的小苗，切成高度为2～3 cm的植株，接种于29～33号处理的培养基中，15 d后统计生根情况。每处理接种5瓶，每瓶接种10株，重复3次。

1.2.6 培养条件以上培养基均为MS，蔗糖30 g/L，琼脂5.0 g/L，pH值为5.8～6.0，光照强度为1 600～2 000 lx，培养室温度为（25±2）℃。

1.3 测定项目及方法

计算愈伤组织诱导率、不定芽分化率、芽增殖率和生根率。

愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%；不定芽分化率＝产生芽的愈伤组织块数/接种愈伤组织块数×100%；芽增殖率＝不定芽产生的数量/接种芽数×100%；生根率＝生根苗数/接种苗数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度细胞分裂素6-BA与不同浓度生长素NAA，2，4-D配比对不同部位叶柄愈伤组织诱导的影响

表1 不同浓度激素配比对愈伤组织诱导的影响

从表1可以看出，将上部和中部叶柄分别接种到1～16号培养基中，都能产生愈伤组织，且中部叶柄比上部叶柄愈伤组织诱导率高，诱导效果以14～16号处理较好，在16号培养基中愈伤组织出现最早、生长速度最快，诱导率最高，上部叶柄和中部叶柄的诱导率分别达56.6%和90%，但愈伤组织结构疏松；其次为15号培养基，上部叶柄和中部叶柄的诱导率分别为56.6%和86.6%，愈伤组织结构松紧适中。2，4-D的诱导效果要好于NAA，诱导效果随2，4-D，NAA浓度的增加而增加，其中，在含有2，4-D的培养基中，叶柄接种15d左右切口开始膨大，20 d左右形成明显的愈伤组织细胞团（1 cm×1 cm）；含有NAA的培养基中，叶柄接种20 d左右切口才开始膨大，25 d左右才有愈伤组织形成，生长缓慢，30 d愈伤组织诱导情况如图1所示。

2.2 不同浓度细胞分裂素6-BA与不同浓度生长素NAA配比对不定芽分化的影响

由表2可知，在愈伤组织不定芽的分化培养过程中，17～24号处理均能分化不定芽，但不同的处理对不定芽的分化、芽的数量和生长影响不同。随着细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度的增加，不定芽的分化效果明显增强。6-BA为1.5 mg/L，NAA为0.2 mg/L时，分化效果最好，分化率达到90%，芽粗壮、整齐、疏密适中；6-BA为2.0 mg/L，NAA为0.2 mg/L时，不定芽分化较早，但芽点密集、芽伸长不明显、整齐性差，不利于下一步的增殖培养。因此，应以23号处理为好，即MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA0.2 mg/L。不定芽的增殖培养情况图2所示。

表2 不同浓度6-BA与NAA配比对愈伤组织不定芽分化的影响

2.3 不同浓度6-BA与不同浓度NAA配比对增殖培养的影响

由表3可知，25～28号处理均能实现芽的增殖，平均增殖芽2.03～7.03个，其中，28号处理芽的增殖数量最高、芽点最多，但芽密集、纤弱；26，27号处理芽的数量较28号处理少，但芽粗壮、整齐、叶片开展，更有利于下一步的生根壮苗培养。因此26，27号处理更有利于芽的增殖培养。

表3 不同浓度6-BA与NAA配比对芽增殖的影响

2.4 NAA和IBA对生根的影响

从表4可以看出，接种在33号培养基上的小苗，生根效果最好，其生根率达90.66%，平均根数达6.45条；其次为31号培养基，生根率达89.33%，平均根数为5.61条（图3为25 d生根培养，图4为生根苗生长情况）。

表4 不同浓度激素处理对生根的影响

3 结论与讨论

应用组培快繁技术是获得性状统一、稳定、优质的八仙花种苗最为有效的途径之一。叶柄可以诱导出完整植株，当以叶柄作外植体时，中部叶片叶柄的诱导效果明显好于上部叶片叶柄。因为上部叶片叶柄因组织幼嫩，在灭菌过程中，损伤大，容易造成部分组织死亡或褐化，影响了诱导效果。

本研究结果表明，在相同浓度的6-BA条件下，2，4-D，NAA 都能诱导出愈伤组织，2，4-D 对愈伤组织的诱导效果明显好于NAA，其可提前5～10 d产生愈伤组织、愈伤组织生长速度快。但2，4-D浓度过高，易造成愈伤组织结构疏松，不利于不定芽的诱导[4]。适宜愈伤组织诱导的最佳培养基为MS＋6-BA2.5 mg/L＋2，4-D0.2 mg/L。

本研究中，适合不定芽诱导的最佳培养基为MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，诱导率为90%，诱导效果好，易形成不定芽。适合不定芽增殖的最佳培养基为MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA0.2 mg/L，平均增殖芽5.45个，芽粗壮、整齐、成苗高。适合生根的最佳培养基为MS＋IBA0.6 mg/L＋NAA0.4 mg/L，其次为MS＋NAA 0.8 mg/L。IBA和NAA组合使用的生根效果好于单用NAA的效果，根系粗细适中、柔软，不易折断；NAA单独使用时，生根时间短，但根系粗而脆，出瓶时易折断。

［1］徐振华，王学勇.花团锦簇八仙花[J].植物杂志，1999（4）：23.

［2］杨杰雄.花中珍品：八仙花[J].农村实用技术，2002（6）：35.

［3］郭伟珍.八仙花栽培技术[J].河北林业科技，2002（1）：42-43.

［4］龚伟，王米力，石大兴.八仙花离体培养和植株再生[J].植物生理学通讯，2003，39（6）：624.

［5］仼叔辉.八鲜花的组织培养与快繁技术 [J].防护林科技，2006（1）：10-11.

［6］段新玲，任东岁，曹新川，等.大花圆锥八仙花组织培养及快速繁殖技术，1999，11（3）：14-15.

［7］李杨丽.八仙花离体快繁及盆栽生产相关技术研究 [D].武汉：华中农业大学，2010.

［8］姜巍，张巍巍.变异绣球无性系建立的研究 [J].内蒙古农业科技，2007（5）：39-41.

［9］苏荣存，金桂芳.国外引进优良绣球种的组培快繁技术[J].湖北农业科学，2009，48（4）：781-782.

［10］殷丽青，胡永红.优良八仙花品种（Hydrangea serrata‘Preziosa’）的离体培养与快速繁殖[J].上海农业学报，2010，26（1）：38-41.

［11］吴华芬，刘南祥，诸葛华，等.绣球花的植物组织培养和快速繁殖技术[J].浙江农业科学，2009（1）：90-91.

［12］李际红，孟凡志，张友朋.绣球组织培养技术的研究[J].山东林业科技，2002（2）：20-22.