Toll样受体在寄生虫引起的肝胆管纤维化中的作用

韩 慈，刘偲奇，宋 蕾，路 越，李云鹏，张德凯

哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150086

病原体相关性肝胆管纤维化是一种由各种细菌、真菌、病毒和寄生虫导致的胆管细胞损伤和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积在胆管周围而形成的一种肝脏纤维化。Toll样受体是先天免疫系统中一类重要的跨膜受体,它可以识别一种或多种特定的微生物病原体及其产物共有的高度保守分子结构，即病原相关性分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)。Toll样受体在病原体相关性肝胆管纤维化的发生和发展过程中起重要作用。然而，对于这一病理过程和病理机制，人们了解得还不多。但是，为了深入了解病原体相关性肝胆管纤维化的发病机制，从而找到最有效的临床治疗方案，理解Toll样受体在寄生虫引起的肝胆管纤维化中的作用是必需的。寄生虫在肝胆管中的Toll样受体信号通路可能是一个潜在的药物靶点治疗。

1 Toll样受体—免疫系统识别病原体侵袭的关键受体

先天免疫 Toll样受体的发现，是人类医学史上的一项重大发现，赢得2011年诺贝尔医学奖。Toll样受体作为机体天然免疫的第一道屏障，也是识别并结合病原体，激活免疫系统反馈的最重要的受体。Toll样受体在先天免疫反应和炎症反应中起关键作用[1]。Toll样受体家族中不同成员的细胞内定位与其识别的配体的性质有关[2]。在Toll样受体家族中，TLR1、2、4、5、6和11存在于细胞膜上，并能识别细菌成分[3]。然而，抗病毒受体，TLR3、7、8和9识别病毒的核酸成分，这些受体不是在细胞表面表达，而是存在于内核体(endosome)。在病毒进入细胞内且被转运到内核体之后，释放的核酸可以被这些Toll样受体识别出来，从而激活相应的信号通路[4]。寄生虫的糖基磷脂酰肌醇(GPI)[5]及糖醇磷脂(GIPLs)[6]被TLR2复合体识别，所以，TLR2在寄生虫病引起的疾病(如疟疾)中起重要作用。疟原虫色素(Hemozin)被TLR4识别，从而激活免疫反应[7]。研究[8]发现，TLR11识别寄生虫的纤维蛋白 (Profilin)。

2 寄生虫引起的肝胆管纤维化

细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体感染可引起慢性肝脏疾病，以损伤胆管上皮细胞、ECM沉积在胆管周围为特征，称为寄生虫引起的肝胆管纤维化，并最终发展成为胆汁淤积性肝硬化且会因缺乏有效的临床治疗措施最终导致肝脏衰竭和胆管癌。然而，寄生虫引起的肝胆管纤维化[9]与其他种类肝纤维化的形成不同，我们对它的发病机制还知之甚少。Toll样受体作为一种先天性免疫相关受体，起着防御感染和病原体入侵的第一道防线作用，其可识别病原体的保守结构，如病原体包括细菌、病毒、真菌和寄生虫。TLR2和TLR4有多种寄生虫相关性的配体，如原虫、线虫、吸虫和绦虫[10]，其中许多寄生虫可以定植于胆道或间接作用于胆道系统，引发胆系疾病。

2.1后睾肝吸虫后睾肝吸虫是一种常见的胆道寄生虫，其中包含一种由Ov-GRN-1编码的颗粒体蛋白，研究[11]表明，当这种颗粒体蛋白被抑制，后睾肝吸虫刺激引起的胆道上皮细胞扩增状态也将被抑制。后睾肝吸虫还可在代谢过程中产生甾醇，导致血脂代谢异常，引起血脂沉积，致使机体产生高胆固醇血症，从而导致产生胆管纤维化[12]。

2.2华支睾吸虫华支睾吸虫是在亚洲东部地区包括中国、韩国、越南等地区流行的食源性寄生虫。据统计，约1 500万人因进食含有华支睾吸虫的生冷或熟的鱼肉而受到感染。成虫会寄居在终宿主而引起胆管炎、胆石症、胆汁淤积，甚至胆管癌。值得注意的是，华支睾吸虫的慢性感染可以刺激门静脉周围如T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润，这些细胞的相互作用有助于肝胆管纤维化的形成[13]。

2.3其他除了肝吸虫之外，一些其他寄生虫也对胆道产生恶劣的影响，如血吸虫感染后可通过增强Natch1/Jagged1信号后联合TLRs，引起巨噬细胞活化后导致可溶性虫卵抗原M2极化，从而引起胆管及肝脏的纤维化[14]；而肝片吸虫病还可通激活起肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化胆管及肝部肌成纤维细胞，致使产生胆管及肝脏的纤维化[15]。马来丝虫的微丝蚴不仅可以下调人类树突状细胞TLR3和TLR4的表达，也可以使这些细胞对TLR3和TLR4配体的应答降低。研究[16]表明，微丝蚴可通过改变Toll样受体的表达，干扰MyD88依赖的信号通路，从而影响NF-κB的活性，干扰抗原呈递细胞影响T细胞的活化。总的来说，寄生虫是胆道损伤及胆道疾病不可忽视的病因。

胆道纤维化过程中多种细胞被认为通过2EMT导致ECM的生产，包括HSCs、肝祖细胞、汇管区成纤维细胞等间充质细胞[17]。然而，被激活的HSCs因高表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)被认为是最有意义的细胞，它不同于产生ECM的肌成纤维细胞[18]。因此，激活HSCs是肝纤维化形成过程中的中心事件，这是由细胞因子和活性氧的复杂调控网络所执行的[19-20]。尽管许多细胞因子参与肝纤维化的形成过程，但主要促进HSCs激活的是转化生长因子-β1(TGF-β1)，而且它还能通过TGF-β/Smads信号通路促进ECM的产生[21]。

3 TLR4在寄生虫引起的肝胆管纤维化中的作用

Toll样受体是病原体相关分子模式中的最重要模式识别受体，通过天然免疫促进宿主防御机制，控制宿主的适应性免疫应答。最近，TLR4也被证实与肝纤维化的发病机制相关，且TLR4对HSCs的效应起关键作用[22]。激活的TLR4信号可促进骨髓源性肝细胞与内源性肝细胞之间的交叉，促进TGF-β的释放和提高HSCs对TGF-β 的敏感性。

3.1TLR4突变可以抑制胆管纤维化研究[13]表明，在华支睾吸虫感染的小鼠TLR4突变可以抑制胆管纤维化。TLR4在华支睾吸虫感染的小鼠高表达，TLR4野生型小鼠在被华支睾吸虫感染后显示出脑叶肿胀和表面的大结节，但突变型小鼠仅在脑叶的表面显示有局限的苍白区域；胶原蛋白沉积在感染后的野生型小鼠和突变型小鼠都明显增加，而野生型小鼠的胶原沉积含量明显高于突变型小鼠；且突变型小鼠较野生型小鼠的羟脯胺酸含量减少2倍，这些数据表明，TLR4与病原体相关性胆管纤维化相关。

3.2TLR4介导的信号通路TLR4介导的信号通路对华支睾吸虫引起纤维化有重要影响[13]。对比未被华支睾吸虫感染的小鼠与被华支睾吸虫感染的小鼠，感染的小鼠有较高水平的α-SMA和I型胶原蛋白(无论在TLR4野生型小鼠和TLR4缺失型小鼠)。然而，野生型小鼠的α-SMA 和I型胶原蛋白要显著高于TLR4缺失型小鼠。通过Western blotting分析显示，MyD88和磷酸化NF-κB对于华支睾吸虫感染的野生型小鼠和缺失型小鼠都显著生长，而突变型小鼠显著低于野生型小鼠。感染的野生型小鼠的MyD88和磷酸化NF-κB比未被感染的小鼠增加2倍。且相比突变型小鼠，MyD88和磷酸化NF-κB高表达于野生型小鼠，这说明损伤TLR4通路能阻止华支睾吸虫引起的肝胆管纤维化。

3.3损伤TLR4会阻止转化生长因子介导的寄生虫引起的肝胆管纤维化由于转化生长因子对于HSCs的活化及细胞外基质的生产是至关重要的，且我们先前提到转化生长因子信号通路在华支睾吸虫感染的小鼠中不但被激活且会促进胆管纤维化[23]。与未感染小鼠相比，转化生长因子和p-Smad2/3在感染后的TLR4野生型和突变型小鼠中都是高表达的，但对比感染的野生型小鼠，TLR4缺失型小鼠的转化生长因子和p-Smad2/3表达明显受到抑制。此外，以往的研究[20]表明，TLR4配体会下调转化生长因子的虚拟受体用来促进HSC对转化生长因子的敏感性。研究[13]发现，在尝试使用相统计量华支睾吸虫造模时，转化生长因子的虚拟受体在缺失型小鼠相对于野生型小鼠显著增加。这些数据表明，TLR4缺陷将会减少转化生长因子介导的寄生虫引起的肝胆管纤维化。

3.4减少HSCs在华支睾吸虫感染的TLR4缺失型小鼠在肝脏中的激活HSCs作为生物标志分化成肌成纤维细胞，α-SMA可被染色用于评价在华支睾吸虫感染的缺失型小鼠和野生型小鼠活化的HSCs[13]。对于未感染小鼠，HSCs表达α-SMA或肌成纤维细胞在TLR4缺失型和野生型的健康型小鼠中很难找到，然而大量的HSCs和肌成纤维细胞在华支睾吸虫感染的TLR4缺失型或野生型小鼠的胆管周围被抗α-平滑肌肌动蛋白抗体强染色。然而相比缺失型小鼠，α-SMA的表达在华支睾吸虫感染的野生型小鼠的肝脏中显著增加，提示TLR4功能缺陷会减弱HSCs因华支睾吸虫感染引起的寄生虫引起的肝胆管纤维化。

寄生虫引起的肝胆管纤维化是特殊类型的肝纤维化，其特点是胆管上皮细胞增生、肝门静脉炎症细胞浸润、肌成纤维细胞的活化。然而，对寄生虫引起的肝胆管纤维化持续性和进展性的机制仍然知之甚少，目前的研究显示，Toll样受体与寄生虫引起的肝胆管纤维化相关，且TLR4缺陷能改善体内因华支睾吸虫引起的胆管纤维化和在体外敲除TLR4信号通路后能减弱HSCs对ECM的产生。总之，TLR4信号通路会促进华支睾吸虫引起的寄生虫引起的肝胆管纤维化[13]。

研究[24-25]显示，在小鼠感染华支睾吸虫28 d后会形成大量的胆管周围纤维化，且年幼的华支睾吸虫在感染21～23 d时会在胆管周围发展成为成虫。此外，最近研究显示，在华支睾虫感染的小鼠的肝脏中会检测到虫卵(无论缺失型还是野生型小鼠都是100%的感染率)。更重要的是，在华支睾吸虫感染小鼠28 d后TLR4的表达升高且高表达于HSCs和成肌细胞，这说明TLR4在这种类型的肝纤维化中扮演重要角色[24]。

越来越多的数据表明，先天性免疫参与各种有害刺激引起的纤维化过程。Toll样受体是模式识别受体中的保护性家族，它在感染和未感染的疾病中都能启动先天性免疫应答和适应性免疫应答[13-20]。然而，TLR4似乎在不同的微环境调节纤维化的过程中发挥不同的作用[26]。例如，TLR4信号通路通过调节转化生长因子信号通路在非感染性肝脏纤维化中起到促进HSCs细胞活化及肝纤维化的作用[20-27]，然而TLR4在肺损伤模型中却作为一个阻止纤维化的负性调节[28-29]。最新的研究[18]表明，HSCs 是毒性、胆固醇和脂肪型肝纤维化中促进肌成纤维细胞产生胶原蛋白的普遍原因，这更支持了 TLR4 突变能减弱因华支睾吸虫引起的胆管纤维化和野生型小鼠因感染华支睾吸虫而引起 HSCs 的激活增加。

转化生长因子是介导纤维化的最强效的介导因子且参与 HSCs 的激活，研究[23]表明，这种通路也参与华支睾吸虫引起的纤维化。但仅有转化生长因子基因转移的小鼠最终不能发展成为肝脏纤维化，其过程需要协同因子的参与[30]。研究[13]发现，转化生长因子的虚拟受体在华支睾吸虫感染的TLR4野生型小鼠和被华支睾吸虫的分泌—排泄产物处理后的 HSCs 中表达显著降低。因转化生长因子的虚拟受体表达于HSCs表面，从而会通过转化生长因子介导HSCs的活化，造成虚拟受体的下调[20,31-32]。在TLR4基因敲除后，转化生长因子的虚拟受体的表达显著增加，下游pSmad2/3减少，且研究数据表明，TLR4介导的TNF-α通过NF-κB抑制虚拟受体的转录活性[33]。在 TLR4信号通路被敲除后胆管上皮细胞(BECs)受到ESPs刺激时，TNF-α的表达显著降低[34]。因此可以想到 TLR4 信号通路缺失导致TNF-α降低是造成转化生长因子的虚拟受体表达上调的原因，从而不利于激活HSCs和寄生虫引起的胆管纤维化。

总之，目前的研究为寄生虫引起的肝胆管纤维化的作用提供了证据，这些证据可能有助于更好地理解寄生虫引起的肝胆管纤维化发展时发生的先天性免疫反应。鉴于Toll样受体参与寄生虫引起的肝胆管纤维化，Toll样受体信号通路需要我们进一步探索及研究。

[1] MOHAMMAD HOSSEINI A, MAJIDI J, BARADARAN B, et al. Toll-like receptors in the pathogenesis of autoimmune diseases [J]. Adv Pharm Bull, 2015, 5 (Suppl 1): 605-614. DOI: 10.15171/apb.2015.082.

[2] TSUNEYAMA K, BABA H, MORIMOTO Y, et al. Primary biliary cholangitis: its pathological characteristics and immunopathological mechanisms [J]. J Med Invest, 2017, 64 (1.2): 7-13. DOI: 10.2152/jmi.64.7.

[3] GHOSH C, PRAKASH N R, MANNA S K, et al. Presence of toll like receptor-2 in spleen, lymph node and thymus of Swiss albino mice and its modulation by Staphylococcus aureus and bacterial lipopolysaccharide [J]. Indian J Exp Biol, 2015, 53(2): 82-92.

[4] ABDELSADIK A, TRAD A. Toll-like receptors on the fork roads between innate and adaptive immunity [J]. Hum Immunol, 2011, 72(12): 1188-1193. DOI: 10.1016/j.humimm.2011.08.015.

[5] GURALE B P, HE Y, CUI X, et al. Toward the development of the next generation of a rapid diagnostic test: synthesis of glycophosphatidylinositol (GPI) analogues of plasmodium falciparum and immunological characterization [J]. Bioconjug Chem, 2016, 27(12): 2886-2899. DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00542.

[6] ASSIS R R, IBRAIM I C, NORONHA F S, et al. Glycoinositolphospholipids from Leishmania braziliensis and L.infantum: modulation of innate immune system and variations in carbohydrate structure [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2012, 6(2): e1543. DOI：10.1371/journal.pntd.0001543.

[7] MOCKENHAUPT F P, CRAMER J P, HAMANN L, et al. Toll-like receptor (TLR) polymorphisms in African children: common TLR-4 variants predispose to severe malaria [J]. J Commun Dis, 2006, 38(3): 230-245. DOI: 10.1073/pnas.0506803102.

[8] YAROVINSKY F, ZHANG D, ANDERSEN J F, et al. TLR11 activation of dendritic cells by a protozoan profilin-like protein [J]. Science, 308(5728): 1626-1629. DOI: 10.1126/science.1109893.

[9] ZOU W L, YANG Z, ZANG Y J, et al. Inhibitory effects of prostaglandin E1 on activation of hepatic stellate cells in rabbits with schistosomiasis [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2007, 6(2): 176-181.

[10] MUKHERJEE S, KARMAKAR S, BABU S P. TLR2 and TLR4 mediated host immune responses in major infectious diseases: a review [J]. Braz J Infect Dis, 2016, 20(2): 193-204. DOI: 10.1016/j.bjid.2015.10.011.

[11] PAPATPREMSIRI A, SMOUT M J, LOUKAS A, et al. Suppression of Ov-grn-1 encoding granulin of Opisthorchis viverrini inhibits proliferation of biliary epithelial cells [J]. Exp Parasitol, 2015, 148: 17-23. DOI: 10.1016/j.exppara.2014.11.004.

[12] JOOB B, WIWANITKIT V. Opisthorchiasis, hypercholesterolemia, and cholangiocarcinoma: a reappraisal [J]. South Asian J Cancer, 2017, 6(1): 35. DOI: 10.4103/2278-330X.202561.

[13] YAN C, LI B, FAN F, et al. The roles of Toll-like receptor 4 in the pathogenesis of pathogen-associated biliary fibrosis caused by Clonorchis sinensis [J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 3909. DOI: 10.1038/s41598-017-04018-8.

[14] ZHENG S, ZHANG P, CHEN Y, et al. Inhibition of Notch signaling attenuates schistosomiasis hepatic fibrosis via blocking macrophage M2 polarization [J]. PLoS One, 2016, 11(11): e0166808. DOI: 10.1371/journal.pone.0166808.

[15] MACHICADO C, MACHICADO J D, MACO V, et al. Association of Fasciola hepatica infection with liver fibrosis, cirrhosis, and cancer: a systematic review [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2016, 10(9): e0004962. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004962.

[16] DE LA TORRE-ESCUDERO E, PEREZ-SANCHEZ R, MANZANO-ROMAN R, et al. Schistosome infections induce significant changes in the host biliary proteome [J]. J Proteomics, 2015, 114: 71-82. DOI: 10.1016/j.jprot.2014.11.009.

[17] KOYAMA Y, WANG P, LIANG S, et al. Mesothelin/mucin 16 signaling in activated portal fibroblasts regulates cholestatic liver fibrosis [J]. J Clin Invest, 2017, 127(4): 1254-1270. DOI: 10.1172/JCI88845.

[18] DE OLIVEIRA DA SILVA B, RAMOS L F, MORAES K C M. Molecular interplays in hepatic stellate cells: apoptosis, senescence, and phenotype reversion as cellular connections that modulate liver fibrosis [J]. Cell Biol Int, 2017, 41(9): 946-959. DOI: 10.1002/cbin.10790.

[19] PARSONS C J, TAKASHIMA M, RIPPE R A. Rippe, molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2007, 22 Suppl 1: S79-S84. DOI: 10.1111/j.1440-1746.2006.04659.x.

[20] XIANG D M, SUN W, NING B, et al. The HLF/IL-6/STAT3 feedforward circuit drives hepatic stellate cell activation to promote liver fibrosis [J]. Gut, 2017, pii: gutjnl-2016-313392. DOI: 10.1136/gutjnl-2016-313392.

[21] SAAS P, VARIN A, PERRUCHE S, et al. Recent insights into the implications of metabolism in plasmacytoid dendritic cell innate functions: Potential ways to control these functions [J]. Version. F1000Res, 2017, 6: 456. DOI: 10.12688/f1000research.11332.2.

[22] HARADA K, NAKANUMA Y. Innate immunity in the pathogenesis of cholangiopathy: a recent update [J]. Inflamm Allergy Drug Targets, 2012, 11(6): 478-483. DOI: 10.2174/187152812803589976.

[23] YAN C, WANG L, LI B, et al. The expression dynamics of transforming growth factor-beta/Smad signaling in the liver fibrosis experimentally caused by Clonorchis sinensis [J]. Parasit Vectors, 2015, 8: 70. DOI: 10.1186/s13071-015-0675-y.

[24] YAN C, LI X Y, LI B, et al. Expression of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in the livers of mice infected by Clonorchis sinensis [J]. J Infect Dev Ctries, 2015, 9(10): 1147-1155. DOI: 10.3855/jidc.6698.

[25] KIM E M, YU H S, JIN Y, et al. Local immune response to primary infection and re-infection by Clonorchis sinensis in FVB mice [J]. Parasitol Int, 2017, 66(4): 436-442. DOI: 10.1016/j.parint.2016.11.006.

[26] HUEBENER P, SCHWABE R F. Regulation of wound healing and organ fibrosis by toll-like receptors [J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1832(7): 1005-1017. DOI: 10.1016/j.bbadis.2012.11.017.

[27] CHEN Y, ZENG Z, SHEN X, et al. MicroRNA-146a-5p negatively regulates pro-inflammatory cytokine secretion and cell activation in lipopolysaccharide stimulated human hepatic stellate cells through inhibition of Toll-like receptor 4 signaling pathways [J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(7): 1076. DOI: 10.3390/ijms17071076.

[28] DI STEFANO A, RICCIARDOLO F L M, CARAMORI G, et al. Bronchial inflammation and bacterial load in stable COPD is associated with TLR4 overexpression [J]. Eur Respir J, 2017, 49(5): 1602006. DOI: 10.1183/13993003.02006-2016.

[29] HUANG C, PAN L, LIN F, et al. Monoclonal antibody against Toll-like receptor 4 attenuates ventilator-induced lung injury in rats by inhibiting MyD88-and NF-kappaB-dependent signaling [J]. Int J Mol Med, 2017, 39(3): 693-700. DOI: 10.3892/ijmm.2017.2873.

[30] FRIEDMAN S L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis [J]. Gastroenterology, 2008, 134(6): 1655-1669. DOI: 10.1016/j.bpg.2011.02.005.

[31] LIN L, WANG Y, LIU W, et al. BAMBI inhibits skin fibrosis in keloid through suppressing TGF-beta1-induced hypernomic fibroblast cell proliferation and excessive accumulation of collagen I [J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(8): 13227-13234.

[32] TERATANI T, TOMITA K, SUZUKI T, et al. A high-cholesterol diet exacerbates liver fibrosis in mice via accumulation of free cholesterol in hepatic stellate cells [J]. Gastroenterology, 2012, 142(1): 152-164, e10. DOI: 10.1053/j.gastro.2011.09.049.

[33] LIU C, CHEN X, YANG L, et al. Transcriptional repression of the transforming growth factor beta (TGF-beta) Pseudoreceptor BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) by Nuclear Factor kappaB (NF-kappaB) p50 enhances TGF-beta signaling in hepatic stellate cells [J]. J Biol Chem, 2014, 289(10): 7082-7091. DOI: 10.1038/sj.onc.1203146.

[34] YAN C, WANG Y H, YU Q, et al. Clonorchis sinensis excretory/secretory products promote the secretion of TNF-alpha in the mouse intrahepatic biliary epithelial cells via Toll-like receptor 4 [J]. Parasit Vectors, 2015, 8: 559. DOI: 10.1186/s13071-015-1171-0.