环状RNAs在肝细胞癌中的作用*

周旭红 居林玲 顾春燕 邵建国 卞兆连#

南京中医药大学1(210023) 南通大学附属第三人民医院 南通市肝病研究所2

一、环状RNAs(circular RNAs，circRNAs)概述

CircRNAs是一类新型的内源性非编码RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)，大量存在于真核细胞转录组中，具有多种生物学功能。CircRNAs最早发现于20世纪70年代，1976年Sanger等[1]在一些植物的类病毒中首次观察到这种通过共价键首尾相连的闭合环状RNA。1979年Hsu等[2]首次通过电子显微镜观察到在部分真核生物的细胞质中亦存在共价连接的circRNAs。然而，circRNAs一度被认为是前体RNA剪接过程中发生的错误，并未引起研究者的足够重视，研究进程被一再搁置。直至2012年Salzman等[3]首次采用高通量RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq)对circRNAs进行深入研究，发现circRNAs具有多种生物学功能，是细胞基因表达的一种普遍形式，广泛存在于人类组织中，是数百种人类基因的主要转录形式，circRNAs与人类生命活动存在密切联系。诸多研究表明，circRNAs广泛参与人类疾病的发生、发展，在多种癌症的发病机制中发挥重要作用，可作为潜在的疾病诊断和预测生物学标志物，为癌症的诊断和靶向治疗提供新思路。至此掀起circRNAs的研究热潮。

CircRNAs是一类新型ncRNAs，与经典线性剪接不同，circRNAs的形成通过反向剪接将下游5’位剪接供体与上游3’位剪接受体连接，通过共价键形成闭合的环状结构，不易被核糖核酸酶R(RNase R)降解[4]。CircRNAs的表达具有普遍性、保守性、组织特异性、细胞特异性、发育阶段特异性、稳定性等特征[5-6]，可能在诸多生理病理过程中发挥重要的生物学功能。近年来，circRNAs与肿瘤的关系备受关注，研究[7-9]发现circRNAs在胃癌、食管癌、结直肠癌等肿瘤中存在差异表达，且与肿瘤转移存在一定关联，提示circRNAs可作为潜在的临床生物学标志物和肿瘤治疗靶标，在肿瘤预防、诊断、治疗等方面具有重要价值。

二、CircRNAs的功能

CircRNAs拥有微RNA(miRNA)应答元件(miRNA response element,MRE)，是竞争性内源性RNAs(ceRNAs)的一种类型，能竞争性结合miRNA，抑制其与靶标结合，从而调控靶基因表达[5-6]。部分circRNAs相较一般ceRNAs具有更多的 miRNA结合位点，能更好地抑制miRNA活性，具有强效吸附miRNA的作用。CircRNAs作为miRNA海绵吸附miRNA并调控其功能是circRNAs参与癌症发生、发展过程的重要机制[10-11]。

Zhang等[12]的研究发现，在细胞核内，内含子来源的circRNAs ci-ankrd52在其转录位点大量聚集，并促进RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)依赖的转录过程。敲低ci-ankrd52可导致其亲本基因表达下调。Li等[13]亦发现circEIF3J和circPAIP2可通过顺式调节作用，促进其亲本基因的表达。上述研究提示circRNAs参与调控基因的转录、表达。Ashwal-Fluss等[14]的研究发现circMbl及其侧翼内含子包含保守的MBL结合位点，且由MBL特异性约束，MBL可促进circMbl的合成。当MBL过多时，circMbl合成增加，相应的线性RNA合成减少，使MBL转录减少，从而减少MBL含量，反之亦然。提示circRNAs可通过竞争调控前体RNA的修饰，影响剪接与后剪接相互作用，从而调节线性RNA的生成。

2017年Legnini等[15]发现circ-ZNF609通过剪接依赖和帽独立的方式翻译蛋白质，为真核生物circRNAs编码蛋白质提供了依据。2018年Yang等[16]证实circ-FBXW7翻译形成的蛋白FBXW7-185aa可协同母基因编码的FBXW7蛋白调控原癌基因c-myc蛋白的稳定性，抑制恶性胶质瘤的发生、发展。Du等[17]发现circ-Foxo3能够与细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21结合形成circ-FOXO3-CDK2-p21三元复合物，抑制CDK2与细胞周期蛋白A、E的联系，进而抑制细胞周期进展。上述研究发现，circRNAs既能翻译蛋白质，同时亦能与蛋白质形成复合物，调控蛋白功能，进一步拓展了circRNAs的功能研究领域。

三、CircRNAs与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的关系

HCC是消化系统常见恶性肿瘤之一，每年全球近75万患者死于肝癌，高居全球癌症相关性死亡原因第3位，且发病率呈不断增加趋势，严重危害人类生命健康[18]。病毒性肝炎、酒精性肝病、黄曲霉素等被认为是HCC的危险因素[19]，但具体发病机制尚未完全明确，且缺乏早期诊断的临床生物学标志物。目前临床最常用的检测HCC的标志物是甲胎蛋白(AFP)，但其特异性和敏感性均不理想[20]。2010年版美国肝病研究学会(AASLD)指南已不再将AFP作为筛查HCC的首选指标[21]。治疗方面，目前临床常用的治疗HCC的方法主要是外科手术，但仅约30%的患者在确诊HCC后可行手术治疗。其他治疗方法主要包括肝移植、经皮局部消融、动脉栓塞、放化疗等，经过综合临床治疗，目前HCC 5年复发率仍高达70%以上[22]。HCC高致死率、高转移率、高复发率的特点，使寻找HCC的早期诊断标志物和新型靶向治疗方法成为近年的研究热点。

Conn等[23]发现大量circRNAs在上皮-间质转化(EMT)过程中受调节，而EMT是胚胎发育过程中重要的生物学行为，在肿瘤的形成、演进中发挥重要作用。因此，推测circRNAs在肿瘤的发生、发展中扮演了重要角色。与相应癌旁组织相比，circRNAs在肿瘤组织中差异表达，表现为上调或下调，推测其起致癌或抑癌作用。尽管许多circRNAs以低水平表达，但部分circRNAs含量较同一基因来源的线性RNA更为丰富，甚至为线性RNA的10余倍[24]，且circRNAs在唾液、血液和外泌体中的表达较线性RNA更稳定，可作为癌症诊断、预后以及治疗反应的潜在生物学标志物[25-26]。

Ren等[27]采用系统生物学方法构建并分析circRNAs在HCC中的分子调控网络。共检测到127个差异表达的circRNAs和3 235个差异表达的miRNA，选取其中前5个上调的circRNAs构建circRNA-miRNA-mRNA网络，发现其参与癌症相关通路，如p53信号通路以及关于血管新生和细胞周期的通路等。进一步采用荧光定量PCR法验证此5个circRNAs，结果显示circZFR、circFUT8和circIPO11在HCC中的表达水平显著高于相应癌旁组织，且具有促进HCC增殖、分化的作用。circRNA-miRNA-mRNA网络可能有助于进一步揭示HCC的分子机制。

Shang等[28]对33例HCC患者的癌组织和相应癌旁组织circRNAs表达情况进行分析，发现61个circRNAs差异表达，其中26个circRNAs上调，35个circRNAs下调。其中hsa_circ_0005075在HCC组织中显著上调，其表达变化与肿瘤大小相关，且显示出较高的诊断价值。进一步研究发现，hsa_circ_0005075可通过影响细胞黏附参与HCC的发生、发展。Huang等[29]通过circRNAs微阵列分析4例HCC患者的癌组织及其相应癌旁组织，确定了226个差异表达的circRNAs，其中189个上调，37个下调。circRNA-100338表达在HCC组织中显著上调，且与患者预后密切相关。进一步研究发现，circRNA-100338在HCC中充当miR-141-3p的内源性海绵，与miR-141-3p相互拮抗，调控HCC的侵袭性。Yu等[30]的研究发现，circRNA Cdr1as(ciRS-7)在HCC组织中表达上调，可能通过与miR-7相互作用，抑制CCNE1和PIK3CD基因表达，从而促进HCC细胞增殖和侵袭。Xu等[31]的研究发现HCC组织中Cdr1as高表达与肝微血管侵犯(MVI)、AFP水平和年龄相关，是肝MVI的独立因素之一，Cdr1as有望成为肝MVI生物学标志物和抑制肝MVI的新型治疗靶点。既往有研究发现，HCC的发病可能与性激素相关[32]。Shi等[33]分析了HCC细胞中雄激素受体(AR)对circRNAs表达的影响，结果发现AR通过上调RNA编辑酶ADAR1，抑制circRNAs表达。进一步研究发现AR可能通过调控circARSP91(hsa_circ_0085154)的表达，参与原发性HCC的发病机制。上述研究表明circRNAs可在HCC组织中表达上调，通过不同的机制参与HCC发病。

Yao等[34]的研究结果显示，circZKSCAN1在HCC组织中的表达明显低于相应癌旁组织。 circZKSCAN1通过与ZKSCAN1 mRNA相互作用，可抑制HCC生长、迁移和侵袭。Qin等[35]分析了89例HCC及其相应癌旁组织发现，hsa_circ_0001649的表达在HCC组织中较癌旁组织显著下调，进一步分析发现hsa_circ_0001649的表达水平与肿瘤大小和栓塞的发生呈正相关。Fu等[36-37]的研究发现，hsa_circ_0005986和hsa_circ_0004018在HCC中的表达水平显著低于相应癌旁组织，且与肿瘤大小、分化程度、TNM分期以及AFP水平等相关。进一步研究发现，hsa_circ_0005986下调可促进G0/G1期至S期的转化，加速细胞增殖，此过程主要依靠miRNA海绵的吸附作用实现。hsa_circ_0004018表达伴随疾病进展而逐渐下降。此外，Fu等[38]发现hsa_circ_0003570表达在HCC组织中亦发生下调，其表达水平与肿瘤大小、数量、肝硬化程度、血管侵袭、微血管浸润以及肿瘤分级等相关，且在慢性肝炎、肝硬化和HCC中的表达水平逐渐降低。Zhang等[39]研究发现，hsa_circ_0001445在HCC组织中的表达显著降低，可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭。进一步研究显示，hsa_circ_0001445在HCC患者中的表达水平显著低于肝硬化、乙型肝炎患者和正常人。Yu等[40]的研究发现，HCC中hsa_circ_0001445表达下调与细胞侵袭性显著相关，且是HCC切除术后患者总生存期和无复发生存期的独立危险因素。其机制可能为，hsa_circ_0001445作为miR-17-3p和miR-181b-5p海绵，可促进肿瘤抑制因子金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP3)表达，发挥抑制HCC增殖、迁移等作用。Han等[41]的研究显示circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135)表达在HCC组织中显著下调，通过吸附miR-9，促进p21表达，进而抑制HCC进展。circMTO1表达降低与HCC患者预后差显著相关。上述研究显示，circRNAs在HCC中表达下调，其主要作为miRNA海绵，吸附miRNA发挥生物学作用，可能与HCC预后潜在相关。

四、结语和展望

在过去数十年中，circRNAs一直被认为是RNA剪接过程中的“噪音”，随着高通量测序和生物信息技术的发展，circRNAs的生理功能及其与疾病间的关系不断被发掘，其在生理和病理过程中具有重要价值，已成为新的研究热点。circRNAs具有高度的组织和细胞特异性，且在体液中具有更高的稳定性，在HCC的诊断和预后判断等方面具有良好的应用前景。circRNAs作为miRNA海绵，可抑制miRNA的功能，为HCC的靶向治疗提供了新思路。诸多研究证实，circRNAs可通过多种机制参与HCC的发生、发展，但其表达丰度较低，且目前对circRNAs的研究尚处于起步阶段，具体作用机制尚未完全阐明，仍需进一步研究探索。现阶段应加快对circRNAs的研究进程，逐步完善circRNAs相关数据库，建立标准化检测方案，以期实现从基础向临床的转化。