细针型共聚焦激光显微内镜在胰腺囊性病变中应用的研究进展

李璇璇 狄 扬 郝思介 金 忱 钟 良

复旦大学附属华山医院消化内科1(200040) 胰腺外科2

胰腺囊性病变(pancreatic cystic lesions,PCLs)过去曾被认为是十分少见的疾病。随着CT、MRI的普及和发展，其检出率逐渐升高。根据所用影像学技术，PCLs的发病率有很大差异，腹部B超所得发病率为0.2%，CT为1.2%～2.6%，MRI为2.4%～13.5%[1]。然而Kimura等[2]的尸检研究显示PCLs的患病率高达24.3%。PCLs的鉴别诊断一直是临床难点。一项纳入330例偶然发现PCLs患者的回顾性研究[3]显示，三分之一患者的术前诊断有误。胰腺手术创伤极大，将良性病变误诊为恶性会给患者带来不必要的手术风险，而将恶性或交界性病变误诊为良性则会显著影响患者预后和生存率。因此提高PCLs的鉴别诊断水平具有重要临床意义。共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy,CLE)是近年来迅速发展的新技术，可实现内镜下细胞水平的观察，使实时组织病理学检查成为可能。其中细针型CLE(needle-based CLE,nCLE)尤其适用于PCLs的诊断[4]。本文对nCLE在PCLs中应用的研究进展作一概述。

一、PCLs的分类和诊断现状

PCLs可分为非肿瘤性病变和肿瘤性病变，前者包括胰腺真性囊肿和假性囊肿(pseudocyst)。胰腺假性囊肿是指胰腺内或胰周异常体液潴留形成的囊腔，多见于急、慢性胰腺炎、外伤、胰腺手术后等，其囊壁没有上皮细胞，可与真性囊肿区分[5-6]。肿瘤性病变最主要的类型有浆液性囊性肿瘤(serous cystic neoplasm,SCN)、导管内乳头状黏液瘤(intra-ductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)、黏液性囊性肿瘤(mucinous cystic neoplasm,MCN)等，其中囊液为黏液性的IPMN和MCN恶变率较高，需尽早手术治疗，而浆液性的SCN恶变罕见[7-11]，对SCN和非肿瘤性病变往往采取保守治疗和随访。因此，临床上鉴别PCLs的囊液是否为黏液性至关重要。其他PCLs还有实性假乳头状瘤、胰腺囊性神经内分泌肿瘤等。

目前PCLs诊断的主要依据是临床表现、血清学检查以及腹部B超、CT、MRI、内镜超声引导下细针穿刺活检(endoscopic ultrasonography-guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)等。PCLs的临床表现包括腹痛、胰腺炎、黄疸、消瘦、恶心等，但绝大多数患者无任何不适，在体检时发现病变，因此症状无法指导诊断。血清学检查中，PCLs无特异性肿瘤标志物，半数以上患者血清学检查结果为阴性，鉴别诊断作用十分有限。腹部B超应用广泛，可观察胰腺、胰腺导管和病灶，但存在明显局限性。超声波在到达胰腺之前经过腹部脂肪、胃肠道等多层结构，导致胰腺显影不清，敏感性较差[12]。自CT、MRI广泛应用以来，PCLs的检出率较以往明显提升。多层螺旋CT(MSCT)空间和时间分辨率高、扫描速度快，对PCLs的诊断价值相对较高，文献报道中其准确性范围较大，在56%～85%之间[13-15]。MRI的准确性为78.9%～81.6%，但有文献报道其观察者间一致性相对较差[16-17]。

EUS结合传统内镜与超声的功能，其探头透过十二指肠或胃壁进行胰腺检查，分辨率高于CT和MRI，且可提示PCLs的侵袭性征象，包括囊内分隔、囊壁结节、实质性成分、血管侵犯、淋巴结转移等[15,18]。EUS检查结果是操作者依赖性的，因此在准确性方面变异度大，其诊断PCLs的准确性在40%～96%之间[9]。对于黏液性与非黏液性PCLs的鉴别，EUS的敏感性、特异性、准确性分别仅为56%、45%和51%[19]。EUS-FNA是在EUS的引导下对病变部位进行细针穿刺以获取细胞、组织或体液标本，从而获得细胞学或病理学依据的检查方法，目前被认为是胰腺疾病诊断最先进、准确的技术，抽吸囊液进行细胞学检查已成为PCLs的标准检查。两项meta分析表明EUS-FNA细胞学区分黏液性与非黏液性PCLs的敏感性分别为63%和54%，特异性分别为88%和93%，敏感性较低但特异性较高[20-21]。临床上有时可能因无法取到足量样本而导致诊断率更低，一项试验中其敏感性、特异性和准确性分别为34.5%、83%和59%[19]。在囊液肿瘤标志物的检测中，CEA对于黏液性PCLs的鉴别最为准确，meta分析显示其敏感性为63%，特异性为88%[21]。其他肿瘤标志物如CA19-9、CA125、CA72-4、CA15-3等准确性均很低[ 9,19]。综合上述研究结果，EUS-FNA囊液分析敏感性欠佳。此外，EUS-FNA在PCLs中的应用往往仅限于细胞学检查，缺乏病理学诊断。

二、CLE概述

CLE是一种结合了微型聚焦激光扫描显微镜的新型内镜技术，其主要特点是镜头放大倍数可达1 000倍，对黏膜组织的观察可达到细胞水平，因此在进行传统内镜检查时，CLE的使用可获得与组织病理学相近的显微图像，实现实时组织学检查，因检测不需取活检而被称之为“光学活检”。

CLE的工作原理为由主机激光器发射蓝色低能耗激光束，经光纤传导后通过物镜在被测部位聚集，组织中的荧光素被激光激发后发射出荧光，探头在探头孔后接收荧光信号，将其转化为数字信号传送至主机，在屏幕上形成放大数百上千倍的灰阶图像[22-23]。

CLE的实施需外源性荧光造影剂配合，早期常用的两种荧光造影剂分别为0.05%盐酸吖啶黄和10%荧光素钠[22]。盐酸吖啶黄可清晰显示细胞核，但有致DNA突变风险，目前已极少使用。荧光素钠价格低廉、安全性好、不致突变，目前仍在普遍使用。静脉注射荧光素钠20 s内即可清晰显像，并可持续约30 min，主要显示血管和组织结构，如上皮细胞、固有膜基质、隐窝结构、脉管系统等，缺点是不能显示细胞核。荧光素钠最常见的不良反应包括一过性皮肤黄染、轻度恶心呕吐、低血压、过敏反应等。

自问世以来，CLE已在Barrett食管、胃部疾病、炎症性肠病、结直肠息肉等消化系统疾病中得到广泛应用，并逐渐扩展至胆胰疾病、肝脏疾病等，在其他专科疾病如呼吸系统、泌尿系统疾病中也有应用[22-29]。

CLE系统分为两种，分别是基于内镜的整合式CLE (endoscope-based CLE,eCLE)和通过内镜活检通道放置的探头式CLE(probe-based CLE,pCLE)。eCLE内镜操作性较差，目前已很少使用。相比之下，pCLE使用便捷、探针多样，适应证广泛。本文所关注的nCLE是目前最细的一种pCLE，可通过EUS-FNA的19G穿刺针，尤其适合探查胰腺。其由10 000根光纤组成，直径仅0.85 mm，长4 m，观察视野320 μm，横向分辨率3.5 μm ，成像深度40～70 μm，一个探头可进行约10次检查[30-31]。

pCLE用于胆胰管狭窄的鉴别诊断已有Miami分类和Paris分类标准[23,32]。相比之下，其用于PCLs的鉴别诊断尚未形成一个行之有效的标准体系，许多团队都在开展相关临床试验，为今后诊断标准的确立奠定了基础。

三、nCLE的研究现状

nCLE的第一个动物实验研究发表于2010年。Becker等[33]成功应用nCLE对猪的多个腹腔脏器进行实时组织学观察，证实了nCLE在活体内成像的可行性。2011年的文献报道中，Mennone等[34]通过大鼠实验证实nCLE可有效鉴别正常肝组织与肝硬化组织。

2011 年，Konda等[35]率先报道了nCLE用于胰腺占位性病变的可行性。研究纳入18例行EUS-FNA的胰腺占位病例，其中16例为囊性病变，2例为实质性病变；17例顺利完成操作，10例图像质量为优或良好。12例预置nCLE探头的病例中，11例操作顺利，6例后置nCLE探头的病例中则有2例插入困难，1例操作失败，由此认为预置nCLE的操作方式更为有效。该研究首次提出nCLE图像中的绒毛样表现可提示IPMN，并指出较之传统EUS-FNA，nCLE实时成像可避免对正常组织进行不必要的活检，从而减少穿刺次数。2013年，该团队进一步报道了nCLE体内鉴别PCLs的初步试验INSPECT(InvivonCLE Study in the Pancreas with Endosonography of Cystic Tumors)结果[36]。该试验中，消化病理医师首先观察26例PCLs病例的nCLE图像，从中总结可区分胰腺囊性肿瘤与非囊性肿瘤的若干描述性特征，然后以之为标准解读另31例PCLs病例的nCLE图像，提出代表上皮绒毛结构的表现，包括手指状突起、中空的暗环以及隐窝样结构等鉴别两者的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为59%、100%、100%、50%和71%。

2015年，Nakai等[37]报道的DETECT(Diagnosis of pancreatic cysts: EUS-guided Through-the-needle confocal laser-induced Endomicroscopy and Cystoscopy Trial)试验评价了SpyGlass光纤探头与nCLE联合对PCLs的诊断价值。SpyGlass系统系基于胆道子母镜，用于胆胰疾病的诊治，可在EUS的配合下将传送导管、探头送入胰腺病变部位进行观察或活检[38-39]。该试验先通过SpyGlass观察囊内容物和囊壁，然后更换nCLE再次观察，30例病例中仅1例探头交换失败。IPMN在SpyGlass下表现为手指样突起和云雾状黏蛋白，在nCLE下表现为乳头状突起和暗环；MCN在SpyGlass下表现为光滑的囊壁和混浊的囊液，在nCLE下可见上皮边界；SCN在SpyGlass下有光滑的囊壁和明显的脉管结构，在nCLE下有浅表血管网结构。作者认为鉴别PCLs是否为黏液性尤为重要，指出SpyGlass见黏蛋白或nCLE见乳头状突起和暗环均提示黏液性PCLs，两者敏感性分别为90%和80%，联合使用敏感性可达到100%，鉴别诊断效能明显提高。

同年报道的Napoléon等[40]开展的CONTACT(Clinical evaluation Of NCLE in The lymph nodes Along with masses and Cystic Tumors of the pancreas)试验则主要针对SCN。研究根据18例患者的nCLE图像总结制订诊断标准，得出特异性的浅表血管网结构为SCN的诊断标准。在31例患者中对此标准进行验证，特异性和阳性预测值均达到100%，敏感性和阴性预测值分别为69%和82%。次年，该团队又报道了一项纳入33例PCLs病例的研究[41]，指出MCN的nCLE表现为代表囊壁上皮边界的灰色条带；假性囊肿则表现为代表缺乏上皮细胞的炎症组织颗粒，色泽可为明亮或灰黑。至此，INSPECT、DETECT、CONTACT三项临床试验结果成为nCLE鉴别诊断PCLs的主要参考标准[42]。

Karia等[43]2016年发表的研究将15例PCLs患者的nCLE图像分发给6名内镜医师进行解读，旨在探讨根据nCLE特征鉴别PCLs的观察者间一致性，结果显示其观察者间一致性和诊断准确性均较低，6项nCLE特征的κ值最高仅0.22，平均诊断准确性仅为46%(20%～67%)。同年报道的Krishna等[44]的研究纳入26例PCLs患者，其中手术患者占77%，nCLE诊断黏液性PCLs的敏感性、特异性和准确性分别为94%、82%和89%。该研究指出结合EUS-FNA组织学和囊液分析可提高鉴别诊断水平。2017年发表的Kadayifci等[45]的研究纳入20例肿瘤直径在2 cm以上的PCLs患者，nCLE诊断黏液性PCLs的敏感性、特异性和准确性分别为66%、100%和80%。2017年国内复旦大学附属华山医院团队发表的临床试验报道，28例患者(其中17例为囊性或囊实性病变)成功进行EUS引导下nCLE检查，均获得质量良好的图像；26例获得病理诊断的患者中，nCLE与病理诊断的符合率为73.1%，其中SCN和IPMN的诊断特异性均达到100%[46]。

四、nCLE的安全性、局限性和未来研究方向

nCLE检查最常见的不良反应为胰腺炎，现有临床研究报道的术后胰腺炎发生率为3%～7%，其中以DETECT试验和国内试验不良反应发生率最高[37,46]。前者的可能原因为SpyGlass与nCLE联合检查耗时较长造成损伤，后者可能与国内相关研究尚处于起步阶段，操作熟练度不够有关。而且国内报道病例数尚少，缺乏代表性。其他还有个别病例发生一过性腹痛、囊内出血等[35-36,47]，程度均较轻。总体而言，nCLE的安全性较好，但不良反应发生率高于传统EUS-FNA[48]。

nCLE的局限性之一是无法对PCLs的整个囊壁进行全面检查，因其进针路径有较为固定的方向，致使探头扫描范围受限。其次，nCLE的观察平面平行于囊壁，而病理切片则是垂直于囊壁的切面，因此寻找对应的特征性结构有一定难度。此外，荧光素钠无法显示细胞核也会在一定程度上影响成像效果。目前的临床试验均为回顾性研究，样本量亦有限。

未来研究方向是开展时间跨度更长、样本量更大的前瞻性研究，可采取多中心合作的方式，进一步探索nCLE对PCLs的诊断价值，确立诊断标准。病理切片可平行于囊壁进行，从而有利于观察在组织学上与nCLE图像相对应的结构。据报道，IPMN囊壁的组织学亚型比囊肿大小或形态预测肿瘤进展的价值更高[37]，通过nCLE进一步鉴别其亚型也是未来的探索方向。开发可使细胞核染色同时对人体无害的荧光造影剂以提高nCLE成像的清晰度也是后续研究方向之一。

五、结语

nCLE可实现实时体内组织学观察，目前临床试验证明其能较为有效地鉴别诊断几种常见PCLs，诊断特异性高，操作亦较安全，有较好的可行性和应用前景，但观察者间一致性有待提高。未来应开展更多大规模临床试验，建立并完善nCLE标准诊断体系，这对提升PCLs的鉴别诊断水平具有重要意义。