修复牙周缺损的细胞膜片构建方法新进展

冯顶丽，卓丽丹，芦 笛，傅 营 综述 郭红延 审校

牙周缺损常见于牙周病和牙周创伤，已经开发的多种材料如骨移植材料、屏障膜和蛋白质产品等，可用于治疗牙周缺损，但难以再生完整的牙周组织。近来，随着组织工程在修复缺损组织中的应用，细胞疗法被引入牙周缺损修复。目前已经证明在机体许多成熟组织器官中存在成体干细胞[1]。2004年，Seo等[2]首次从成年人健康的牙周组织中分离培养并鉴定了牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)。在某些特定条件诱导下，该类细胞可“横向分化”成为其他组织的功能细胞，实现缺损牙周组织的修复和再生。

再生医学的早期临床试验是将种子细胞接种到生物降解的支架中。近几十年来，开发了一种新的细胞转移方法，即细胞膜片技术[3，4]，其无需支架，具有巨大的细胞负载能力，可改善干细胞介导的牙周组织再生。笔者就近年来修复牙周缺损细胞膜片的制备及获取的不同方法进行综述。

1 种子细胞

1.1 牙周膜干细胞细胞膜片 PDLSC是牙周组织工程的主要种子细胞之一，将PDLSC从牙周组织中提取并进行培养，在细胞对数期，根据需要将细胞接种于不同材质的孔板内，然后用特殊的的培养液加以诱导，制备细胞膜片，一般在21 d左右细胞膜片会逐渐成熟，出现边缘卷曲现象，此时获取细胞膜片可用于牙周组织缺损的修复[5,6]。

单一细胞膜片制备相对方便快捷，但存在诸如细胞死亡、骨向分化程度差、血管化不充分、再生结构单一和不完整性等问题 ，不能很好地再生包含软组织和硬组织的复杂牙周组织。共培养策略通过有效地利用细胞间的相互影响，相互作用可能解决上述问题。细胞分泌的各种因子会协调细胞与细胞间、细胞与细胞外基之间的相互作用并调节新再生组织的结构和功能。因此，通过种子细胞增强细胞外基质的形成和保存能力有益于牙周组织的完全再生。

1.2 共培养MSC与PDLSC构建细胞膜片

1.2.1 PDLSC和骨髓间充质干细胞共培养 PDLSC和骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)由于其强的增殖和分化成牙周组织的能力而在牙周组织的再生工程中受到广泛的关注。共培养这两种类型的干细胞，在生理条件下相互作用，同时形成包含有利于组织再生的多种因子的细胞外基质，构建细胞膜片。

共培养PDLSCs和BMMSCs构建的细胞片与单用PDLSCs或BMMSC的细胞膜片相比，表达更高水平的骨和ECM相关的基因和蛋白质，产生的复合组织结构也更类似于体内天然牙周组织[7]。Xie等[8]将人PDLSCs、BMMSC共培养，并通过骨诱导的陶瓷牛骨粉末作为混合型干细胞膜片。当PDLSCs与BMMSC共培养时，ALP活性和增殖动力学上调，同时胶原蛋白Ⅰ，骨钙素和血管内皮生长因子的表达也上调。在体内，混合型hPDLSC团可以模仿牙周膜韧带的微环境，促进牙骨质/牙周韧带样组织再生中新生血管形成。

1.2.2 PDLSC和牙囊干细胞共培养 牙囊细胞被认为包含可形成牙周膜、牙骨质、牙槽骨的牙周膜前体细胞，这些前体细胞具有很强的干细胞特性，统称为牙囊干细胞(dental follicle stem cells，DFSCs)。

李欣等[9]使用比格犬DFSC、PDLSC和混合细胞分别制备细胞膜片。然后，三种类型的细胞膜片以同种异体方式移植到具有三壁牙周缺陷的比格犬牙根表面，骨缺损填充羟磷灰石-磷酸钙(HA-TCP)，设置了填充HA-TCP的对照组。牙周病临床检查，组织学和病理分析表明，混合细胞膜片组的牙周愈合优于对照组，相较于其他单细胞组能获得完整的牙骨质、牙槽骨及规则的牙周膜样结构。王丽颖等[10]提出将人的PDLSC及DFSC混合共同培养，制成细胞膜片。显示DFCS可增强PDLSC的自我更新和多向分化的能力并为其提供良好的微环境，促进牙周组织再生。将其与人DFCs、PDLSCs两种单一细胞膜片进行比较，结果显示混合细胞膜片细胞层数更多，基质分泌量更大。这一特质为其提供了更好的弹性和更稳定的机械性能，增加了其临修复牙周缺损的可操作性。

1.2.3 PDLSC和人脐静脉内皮细胞共培养 Panduwawala等[11]将PDLSC，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)或两种细胞的共培养制备细胞膜片。将细胞膜片以三种不同的组合包裹在人牙根周围，并皮下植入免疫缺陷小鼠。组织学评价显示，在植入2、4和8周后，与对照相比，在实验组中植入的牙根周围观察到牙周韧带样组织排列。此外，在含有HUVEC组的牙周腔内观察到血管腔。在第4周和第8周的实验组中，牙周膜韧带再生，牙骨质生成和成骨都比较明显。此外，研究表明HUVEC的存在可以促进牙周细胞的迁移[12]。单独的PDLSCs、HUVECs和各种比例的两种细胞(1∶1，2∶1，5∶1和1∶5)培养获得细胞膜片，结果显示在1：1和5：1共培养组中观察到更高的碱性磷酸酶(ALP)基因表达，这与ALP蛋白定量一致。与单细胞培养细胞片相比，表现出显著高水平的骨/牙源性标记与初始血管形成[13]。

功能组织再生强调了有利的细胞外基质环境和新血管的形成。在研究中，将PDLSCs和其他干细胞混合培养重建有利的再生微环境，有助于复杂牙周组织的再生。

2 诱导环境对构建细胞膜片的影响

2.1 培养基中添加维生素C 使用加入不同浓度的维生素C(0、10、20、50 mg/ml)诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)构建细胞膜片。研究显示维生素C诱导BMSCs以剂量依赖的方式形成细胞膜片，培养基中维生素C的浓度为50 mg/ml时细胞膜片形成最快。与对照组相比，能产生和保存较高量的胶原和其他ECM成分。此外，维生素C在提高BMSCs的增殖能力的同时却不影响膜片的成骨分化能力[14]。Fl Wei等[15]以不同浓度的维生素C构建人PDLSC膜片，结果显示维生素C可诱导PDLSCs构建高质量的细胞膜片。进一步研究发现维生素C能够诱导PDLSCs中的端粒酶活性，导致细胞外基质Ⅰ型胶原，纤连蛋白和整合素β1，干细胞标记物Oct4，Sox2和Nanog，以及成骨标记物RUNX2，ALP，OCN的上调表达。该诱导方法与传统的培养方法相比，被诱导的细胞具有更强的生物活性，保留了细胞间紧密联系的ECM，而且保留了接近质膜的细胞质微丝和外吐小囊泡，相比更易获得高质量的细胞膜片。将这两种方法制备的细胞片植入裸鼠体内后，经维生素C制备的细胞膜片可分化形成更多的成牙质细胞/成骨细胞样细胞，最终形成更加规则的骨/牙骨质样基质。在体内，利用维生素C诱导PDLSCs产生细胞外基质构建膜片后植入比格犬的牙周缺损模型，6周后发现有牙骨质/牙周韧带样组织形成[16]。

2.2 培养液对PDLSC膜片生物学特性的影响 有研究者取得大鼠发育期根端复合体结构，体外分离并培养细胞，取得上清，制备DAC条件培养液。利用DAC条件培养液和成骨诱导液分别诱导PDLSCs膜片。结果表明，与成骨诱导相比，DAC诱导体系更适合PDLSCs膜片的形成，膜片含有丰富的短棒状细胞和大量细胞外基质，细胞膜片periastin和碱性磷酸酶(ALP)表达丰富，体外成骨基因表达更高[17]。2011年，有研究发现鼠根端乳头条件培养基(APTG-CM)可促进PDLCs向成牙骨质细胞谱系转化的功能，APTG-CM有利于牙周组织再生[18]。2017年，有研究采用骨髓间充质细胞条件诱导液(BMMSCs-CM)与根端牙胚条件诱导液(APTG-CM)分别诱导PDLSCs膜片4、7、10 d。10 d后，BMSCs-CM组的克隆形成率(37%)大于APTG-CM组的克隆形成率(24%)，且BMMSCs诱导液诱导后的PDLSCs膜片可产生更丰富的细胞外基质。扫描电镜可见BMMSCs组细胞膜片表面有矿化沉积和胶原组织形成，APTG-CM组细胞膜片表面有大量胶原纤维状组织形成。可见，BMMSCs诱导液更有利于牙周组织再生[19]。

3 细胞膜片在材料表面的分离技术

胰酶消化法是目前最常用的细胞获取的方法，但细胞膜蛋白损伤大，无法保留完整的细胞间连接和细胞外基质，细胞的早期凋亡率高，体内移植后细胞保持活力的时间短[20]。与此方法相比，其他的分离技术显示了各自的优势。

3.1 温敏材料 温度敏感性材料N-异丙基丙烯酰胺[PNIPAAm]的研发与利用，为胰酶消化存在的上述问题提供了新的解决方法。PNIPAAm材料制备的温敏性培养皿，用于细胞的培养和非机械性降温分离获得细胞片[21]，无需酶消化即可获得完整的细胞膜片。其主要原理是PNIPAAm会随温度的改变呈现不同的整体构型和表面润湿性。37 ℃时，其表面呈弱疏水性，适于细胞黏附和生长；当温度低于32 ℃时，表面呈亲水性并发生溶胀，从而使细胞与培养皿分离。因此，培养的细胞在低温下容易从这样的温度反应表面完整地分离。然而这种由PNIPAAm材料包被的温度培养皿较长的冷却时间会影响细胞功能、PNIPAAm溶解有细胞毒性、PNIPAAm材料的厚度会影响细胞黏附等，因此PNIPAAm聚合物材料进一步改进成为研究热点。

2009年，WANG等[22]通过将丙烯酸衍生的壳聚糖(CSA)和N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)共聚合成温敏性聚(PNIPAAm-co-CSA)水凝胶。当培养温度从37 ℃降低至20 ℃时，CS链具有良好的亲水性和吸湿性。L929细胞黏附和脱离的研究表明，在37℃时PNIPAAm-co-CSA水凝胶表面上的细胞黏附和扩散比PIPAAm水凝胶的表面具有更加优异的细胞亲和力与更快的细胞片脱离。另外也有很多学者对此材料进行了改进[23]，通过各种方法修饰PNIPAAm和PNIPAAm衍生物研制温度反应性细胞培养表面，极大地改善了细胞膜片的获取。

3.2 聚电解质涂层技术 聚电解质改性的表面，也可用于控制细胞片的释放。静电作用并在电化学极化后从导电基底解吸，可使聚电解质吸附到相反电荷的表面。基于这种机制，开发了用于收集细胞片的电响应系统。研究表明，在金属氧化物上的聚(1-赖氨酸)(PLL)接枝的聚(乙二醇)(PEG)单层可以通过基底的电化学极化解吸。利用该原理，可通过施加短的正电位从铟锡氧化物(ITO)中解吸PLL-g-PEG/PEG-RGD单层。换言之，吸附的PLL-g-PEG/PEG-RGD单层成为细胞附着到金属氧化物底物的媒介。该单层解吸时，细胞会失去其附着点而发生分离[24]。

Zahn等[25]利用离子溶解技术诱导细胞膜片分离。首先合成聚电解质多层膜，接种成肌细胞膜片于该多层膜上，这种聚电解质多层膜由底层的多聚赖氨酸/透明质酸和上层的纤连蛋白组成，在培养基中加入多价阳离子-亚铁氰化物以分解破坏聚电解质多层膜，从而引起细胞膜片迅速地从培养皿中脱离。

3.3 其他方法 其他的细胞膜片分离技术也在不断出现，为实现高质量细胞膜片的大量获取奠定了基础。例如Ito等[26]利用磁力使角质形成细胞附着和释放。磁铁矿标记的角质形成细胞在超低附着板上培养，有磁体放置在平板下方时，细胞会均匀地散布在表面，没有磁体放置时细胞将无法扩散。 为了分离细胞片，将磁体从平板下面移除，且将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放置在磁体的表面。移动磁铁到细胞上面，磁力导致角质形成细胞片黏附在磁体表面的PVDF膜上。之后，细胞可随着PVDF膜从磁体表面分离。Qiu等[27]在云母片表面涂抹 A6K溶液，接种成骨细胞在该表面层。当细胞膜片成形且边缘卷起时，无须改变温度，即可用镊子将细胞膜片迅速而完整地从表面分离，与其他分离技术相比，这种分离方式更为简便，且因没有添加其他毒副材料，具有更高的生物安全性。

综上所述，包含软组织和硬组织的功能性牙周样组织的再生是牙周组织的组织工程修复缺损的最终目标，同时也给科研与临床应用带来很大的挑战。与单细胞移植方法相比，细胞膜片的细胞密度和移植效率更高，可高效再生修复牙周缺损，具有广泛的临床应用前景。目前细胞膜片在动物实验中研究较为广泛。虽然其牙周组织再生的效果是肯定的，然而，细胞膜片在牙周再生中的应用还处于初级阶段，仍需要不断的深入研究与改进。

[1] Carreira A C, Zambuzzi W F, Rossi M C,etal.Bone Morphogenetic Proteins: Promising Molecules for Bone Healing, Bioengineering, and Regenerative Medicine.[J].J Vitamins & Hormones, 2015, 99:293-322.

[2] Seo B M, Miura M, Gronthos S,etal.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J].J Lancet, 2004,364(9429):149-155.

[3] Sakaguchi K, Shimizu T, Okano T.Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering[J].J Control Release, 2015, 205:83-88.

[4] Itaba N, Matsumi Y, Okinaka K,etal.Human mesenchymal stem cell-engineered hepatic cell sheets accelerate liver regeneration in mice[J].J Sci Rep, 2015, 5:16169.

[5] Hu J, Cao Y, Xie Y,etal.Periodontal regeneration in swine after cell injection and cell sheet transplantation of human dental pulp stem cells following good manufacturing practice[J].J Stem Cell Res Ther, 2016,7(1):130.

[6] 李 敏, 王 瑶, 于华龙,等.人牙周韧带细胞-聚羟基乙酸支架复合体修复牙周组织缺损[J].中国组织工程研究, 2016, 20(12):1718-1724.

[7] Zhang H, Liu S, Zhu B,etal.Composite cell sheet for periodontal regeneration: crosstalk between different types of MSCs in cell sheet facilitates complex periodontal-like tissue regeneration[J].J Stem Cell Res Ther, 2016,7(1):168.

[8] Xie H, Liu H.A novel mixed-type stem cell pellet for cementum/periodontal ligament-like complex[J].J Periodontol, 2012,83(6):805-815.

[9] 李 欣, 金作林, 吴 琼, 等.应用牙周膜干细胞—牙囊干细胞复合细胞膜片同种异体移植修复比格犬牙周组织缺损的研究[J].口腔疾病防治, 2016，9(4):204-210.

[10] 王丽颖, 金作林, 宋 扬, 等.构建一种新型牙周膜牙囊复合细胞膜片的研究[J].临床口腔医学杂志, 2013，17(4):195-199.

[11] Panduwawala C P, Zhan X, Dissanayaka W L,etal.In vivo periodontal tissue regeneration by periodontal ligament stem cells and endothelial cells in three‐dimensional cell sheet constructs[J].J Periodontal Res，2017 ,52(3):408-418.

[12] Din J, Yin Y Z.The effect of vascular endothelial cells on the proliferation of periodontal ligament cells and gingival fibroblasts[J].J Shanghai J stomato, 2013, 22(5):518.

[13] Pandula P K, Samaranayake L P, Jin L J,etal.Human umbilical vein endothelial cells synergize osteo/odontogenic differentiation of periodontal ligament stem cells in 3D cell sheets[J].J Periodontal Res, 2014,49(3):299-306.

[14] Guo P, Zeng J J, Zhou N.A novel experimental study on the fabrication and biological characteristics of canine bone marrow mesenchymal stem cells sheet using vitamin C[J].J Scanning, 2015,37(1):42-48.

[15] Wei F, Qu C, Song T,etal.Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity[J].J Cell Physiol, 2012,227(9):3216-3224.

[16] Iwata T, Yamato M, Tsuchioka H,etal.Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].J Biomaterials, 2009, 30(14):2716-2723.

[17] 刘一涵, 赵喜聪, 张勇杰,等.不同诱导环境对牙周膜干细胞膜片生物学特性的影响[J].实用口腔医学杂志, 2012, 28(3):279-284.

[18] 宁慧影, 刘宏伟.鼠根端乳头条件培养基诱导下的牙周膜细胞膜片与牙本质管和煅烧骨间的牙周膜再生[J].华西口腔医学杂志, 2011, 29(4):429-433.

[19] 唐雪鹏, 李适廷, 王 崇,等.两种诱导液对牙周膜干细胞膜片生物学活性影响[J].临床军医杂志, 2017, 45(4):373-377.

[20] Yang L, Cheng F, Liu T,etal.Comparison of mesenchymal stem cells released from poly(N-isopropylacrylamide) copolymer film and by trypsinization[J].J Biomed Mater,2012,7(3):035.

[21] Kumashiro Y, Fukumori K, Takahashi H,etal.Modulation of cell adhesion and detachment on thermo-responsive polymeric surfaces through the observation of surface dynamics.[J].J Colloids Surf B Biointerfaces, 2013, 106(3):198-207.

[22] Wang J, Chen L, Zhao Y,etal.Cell adhesion and accelerated detachment on the surface of temperature-sensitive chitosan and poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels[J].J Mater Sci Mater Med, 2009, 20(2):583-590.

[23] Tang Z, Okano T.Recent development of temperature-responsive surfaces and their application for cell sheet engineering[J].J Regen Biomater,2014,1(1):91-102.

[24] Guillaume-Gentil O, Akiy ama Y, Schuler M,etal.Polyelectrolyte Coatings with a Potential for Electronic Control and Cell Sheet Engineering[J].J Adv.Mater, 2008, 20(3):560-565.

[25] Ito A, Hayashida M, Honda H,etal.Construction and harvest of multilayered keratinocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force[J].J Tissue Eng, 2004, 10(5-6):873.

[26] Zahn R, Thomasson E,Guillaume-Gentil O,etal.Ion-inducedcellsheet detachment from standard cell culture surfaces coated with polyelectrolytes[J].J Biomaterials,2012,33(12):3421-3427.

[27] Qiu F, Chen Y, Cheng J,etal.A simple method for cell sheet fabrication using mica surfaces grafted with peptide detergent AK[J].J Macromol Biosci, 2010 ,10(8):881-886.