辅具中颈托的体外细胞毒性试验研究①

栾会芹，谷慧茹，闫和平，张莹莹，樊瑜波

1.国家康复辅具研究中心，北京市100176；2.北京市老年功能障碍康复辅助技术重点实验室，北京市100176；3.民政部康复辅具分析评定重点实验室，北京市100176；4.康复辅具评价重点实验室，北京市100176

颈托属于辅具产品，是颈椎病辅助治疗器具，可应用于各种颈椎问题的辅助治疗中。颈托能制动和保护颈椎，减轻椎间关节创伤性反应，有利于组织水肿的消退和巩固，防止复发。医院常利用颈托辅助治疗颈源性高血压、椎动脉型颈椎病、颅脑损伤患者及头颈部手术患者[1-3]。随着颈椎问题低龄化，日常生活中越来越多人需要颈托来辅助治疗[4-5]。随着使用人群及数量增加，市售颈托品牌也随之增多，产品良莠不齐。颈托大多由高分子泡沫塑料热性材料制成，在佩戴过程中，皮肤与材料形成临界接触面，界面环境对材料的腐蚀、降解、磨损等都会影响材料中物质的释放。当材料中有毒性物质渗出时，将会对皮肤表面及皮下组织等产生不良影响，长时间使用可能会对使用者造成二次伤害。因此颈托不仅需要有良好的理化性能，更需要有良好的生物相容性。2012年英国标准(British standard,BSEN 12182:2012)提出，与人体接触的材料应进行相应生物相容性评估；要求辅助器具的设计和制造应假定物质会从产品中泄漏出来，并以此假设将风险降至最低；标准要求特别注意致癌物质、致突变物质、生殖毒性物质以及其他高度关注物质。

目前我国没有对颈托等接触皮肤辅具进行生物安全性评价的标准[6-7]。在医疗器械生物安全评价体系中，细胞毒性试验是一项重要的评价指标[8]。随着人们对辅具产品质量的要求越来越高[9-11]，保证颈托产品的生物安全性问题已越来越受到国家的重视。根据样品的特性，本实验采用显微镜观察法及浸提液法，检测颈托浸提液接触L929细胞后的体外细胞毒性[12-13]，调查目前国内市售颈托的细胞毒性现状，以期为今后能更好地评价颈托的生物相容性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

颈托为市售，分别购于4个厂家。

1.1.1 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清：美国GIBCO公司。噻唑蓝(Thiazole blue,MTT)、10%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(阳性对照)：美国SIGMA公司。高密度聚乙烯(阴性对照)：中国ALFA AESAR公司。浸提介质为含10%血清细胞培养液。

1.1.2 主要仪器

净化工作台、恒温水浴箱：常州国华电气有限公司。生物安全柜、CO2培养箱：美国THERMO公司。倒置显微镜：日本NIKON公司。酶标仪：瑞士TECAN公司。96孔板：美国CORNING公司。

1.2 方法

参照GB/T 16886.5-2003[14]和GB/T 16175-2008[15]体外细胞毒性的实验原则，采用显微镜观察与MTT比色法，在小鼠成纤维细胞(L929株)上对4种不同品牌颈托细胞毒性进行检测。

1.2.1 样品浸提液制备[16]

颈托分别按每0.1 g样品加1 ml浸提介质及0.2 g样品加1 ml浸提介质两个浓度，阴性对照按每0.2 g高密度聚乙烯加1 ml浸提介质，置(37±1)℃，浸提24 h。空白对照采用10%血清细胞培养液，阳性对照采用10%二甲基亚砜，均与测试样品同条件下制备。

1.2.2 显微镜观察

试验设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、颈托材料组(0.1 g/ml、0.2 g/ml)。将1×104/ml的细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔接种细胞悬液100 μl，每组6孔。置于5%CO2培养箱37℃培养24 h后弃去原培养基，分别加入空白对照、阴性对照、阳性对照、颈托材料(0.1 g/ml、0.2 g/ml)浸提液，于5%CO2培养箱37℃培养72 h，之后置于显微镜下观察。

1.2.3 MTT比色试验

重复上述步骤至分别于5%CO2培养箱37℃培养72 h，之后弃去培养基，加入5 g/L的MTT 20μl，37℃孵育4 h后，弃去上清，加入DMSO 150μl，室温放置酶标仪震荡10 min，在酶标仪490 nm波长处，测定吸光度(optical density,OD)值。计算细胞相对增值率(relative growth rate,RGR)，RGR=实验组OD均值/空白对照组OD均值×100%。根据RGR值判断细胞毒性反应的级别[15]。

2 结果

2.1 显微镜观察试验

各浸提液与细胞接触培养72 h后，0.1 g/ml浸提浓度时，颈托D出现细胞形态异常，死亡较多；0.2 g/ml浸提浓度时，颈托A与颈托D均出现细胞形态异常，细胞数量明显减少，死亡较多。颈托B与颈托C在0.1 g/ml与0.2 g/ml两个浸提浓度时，细胞形态正常，细胞密度较空白对照组小。阴性对照组细胞形态完整，贴壁紧密，与空白对照细胞形态无明显差异。阳性对照组超过50%细胞形态成圆形，细胞死亡较多。

2.2 MTT比色试验

阴性对照细胞毒性为0级，阳性对照组细胞毒性为4级，对照试验系统成立，细胞毒性反应分级见表1[15]。

表1 细胞毒性反应分级

浸提液浓度为0.1 g/ml时，颈托D的RGR为48.3%，样品细胞毒性为3级，具有中度细胞毒性；颈托A的RGR为67.2%，样品细胞毒性反应为2级，具有轻度细胞毒性；颈托B与颈托C的RGR为81%～99%，样品细胞毒性为1级，细胞毒性反应极轻微。

浸提液浓度为0.2 g/ml时，颈托A的RGR为14.7%，具有重度细胞毒性；颈托D的RGR为28.7%，为重度细胞毒性；颈托B与颈托C的细胞毒性为2级，具有轻度细胞毒性。见表2。

3 讨论

体外细胞毒性试验具有通用性，已广泛应用于各种医疗器械及其材料的评价。试验分为三类：浸提液试验、直接接触法试验和间接接触法试验[17-19]。根据评价样品的性质及使用特性等选择试验中的一类或几类[20-22]。

颈托在使用过程中直接与人体皮肤接触，因此最能反映人体使用情况的是直接接触法。但直接接触法对材料的要求较高，适用材料范围有限。因颈托材料密度较小而易漂浮在培养基中，难以与细胞直接接触，故本试验未选用此法。

琼脂覆盖法是间接接触法的一种，研究发现受溶出物在琼脂扩散程度的影响，当溶出物分子量小，易溶于水时，其敏感性高，反之则低[22]。在结果判定时，褪色区域的大小及溶解细胞的比例都是通过实验者观察得到的，受一定主观影响[23]。

浸提液试验包括显微镜观察法和MTT比色法，其原理是使实验样品的浸提液直接接触受试哺乳动物细胞，培养一定时间后，通过对细胞增殖或抑制情况的测试，评价实验样品对细胞的体外毒性作用[24-25]。浸提液试验优点是浸提液可以与细胞广泛接触，对于分析检测样品中可溶出物及其浓度对细胞的影响比较敏感，但不能用于检测难溶于浸提介质的物质。MTT用于定量评价细胞毒性。比色法的原理是黄绿色的MTT被哺乳动物细胞线粒体酶降解形成蓝紫色的物质[26]，DMSO可将其溶解，酶标仪测定其浓度，根据OD定量测定细胞的存活。OD值较大，则表示细胞存活率较高，材料的细胞毒性较小。

从数据统计可知，细胞毒性试验基本上是各种产品材料均选择的试验，其特点是试验周期短，费用低，灵敏度较高。开展细胞毒性安全性筛查可以及时发现问题，提高产品的质量。本次浸提液浓度为0.1 g/ml和0.2 g/ml。MTT比色法检测时，颈托D在0.1 g/ml和0.2 g/ml浸提液的细胞毒性反应分别为3级与4级，为中度与重度细胞毒性。颈托A在0.1 g/ml和0.2 g/ml浸提液的细胞毒性分别为2级与4级，为轻度及重度细胞毒性。以上结果说明颈托A与颈托D均有较高的细胞毒性，在长期佩戴过程中可能会对机体产生不利影响。颈托B与颈托C在这两个浓度时细胞毒性均较低，相对比较安全。可能由于所用颈托材料本身对细胞有一定的毒性作用，或生产工艺不同，其产品中含有的添加成分不同等因素导致或加重细胞毒性反应。虽然本次试验研究中样本量少，但4个厂家样品中有两家的细胞毒性较高，已经反映出问题的严重性，应当引起辅具界重视。

表2 MTT比色法各组测定结果

颈托在常见颈椎问题中使用率较高，因此有必要对其生产原材料及生产工艺等环节进行改进及管控，以减少其细胞毒性，减少对使用者的二次伤害。本试验采用显微镜观察法和MTT比色法，对4个品牌颈托进行细胞毒性检测，初探适合颈托的试验方法，考查了国内部分市售颈托的体外细胞毒性现状，为进一步完善该产品的生物安全评价标准积累了数据。此次样本较少，今后研究我们会加大样本量，做更深入更广泛的研究。今后还需针对具体的材料，选择合适评价标准和方法进行探索和研究。此外，也需要生产厂家引起重视，在高分子泡沫原材料选择及生产工艺等环节进行改良，最大程度减少有害物质释放风险，保证产品生物安全性，降低对使用者的危害。

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