超高效液相色谱—三重四极杆质谱测定沉积物中6种对羟基苯甲酸酯及其代谢产物

赵佳慧

摘 要 建立了一种测定沉积物中6种对羟基苯甲酸酯类化合物及其代谢产物对羟基苯甲酸的定量分析方法。样品用甲醇水（5∶3，V/V）混合液进行两次提取，经Oasis MCX固相萃取柱净化，采用UPLC HSS T3色谱柱分离，以甲醇0.1%（V/V）甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，在多反应监测（MRM）模式下进行定性分析，内标法进行定量分析。结果表明，7种目标物质在0.1～500.0 μg/L范围内有良好的线性关系（r≥0.9995），方法定量限为0.75～1.23 ng/g，回收率为65.5%～88.3%，相对标准偏差为7.4%～13.6%。本方法前处理简单，灵敏度高，选择性好，可用于沉积物中对羟基苯甲酸酯类化合物的测定。

关键词 超高效液相色谱三重四极杆质谱； 对羟基苯甲酸酯； 沉积物

1 引 言

对羟基苯甲酸酯（Parabens），又称尼泊金酯，具有惰性、低毒、低刺激性、低敏感性、广谱抗菌活性、防腐效果不易受pH值影响等特点[1]，已被广泛用于食品、药品及化妆品等防腐方面[2]。Darbre等[3]在人体乳腺肿瘤中发现了对羟基苯甲酸酯； 体内实验和体外实验指出对羟基苯甲酸酯具有雌激素活性[4，5]； Crinnion等[6]则发现对羟基苯甲酸酯会影响内源性雌激素的代谢，并可导致线粒体功能障碍。这些研究使人们对对羟基苯甲酸酯的低毒性这一观点产生了质疑，国标对食品及化妆品等样品中对羟基苯甲酸酯进行了相关限量规定：对羟基苯甲酸（pHB）及其盐类在食物中的最大用量为0.012～0.5 g/kg[7]，在化妆品中单酯用量不超过0.4%，混合酯用量不超过0.8%[8]。

由于对羟基苯甲酸酯在世界范围内的广泛使用， 在土壤、地表水、沉积物、室内空气和灰尘以及生物体中均可检测到对羟基苯甲酸酯的存在[9]， 且由于对羟基苯甲酸酯可抗微生物降解，可导致其在环境沉积物中积累[10]； 沉积物是底栖生物的主要食物来源及生活场所，是水生生态系统的重要组成部分[11]，对羟基苯甲酸酯可能对这些水生生物产生影响。

对羟基苯甲酸酯的测定方法主要有毛细管胶束电动色谱法[12]、高效液相色谱法[13]、毛细管色谱法[14]等。张群林等[15]的研究表明，對羟基苯甲酸酯的色谱测定技术已经有较大的进展，其中较为成熟的是高效液相色谱法，但是相对于色谱质谱联用法而言，后者具有更优的灵敏度和选择性； 目前关于对羟基苯甲酸酯的测定方法大多集中在食品、药品及化妆品等方面，所以建立一种高效、快捷、灵敏的测定沉积物中对羟基苯甲酸酯的定量方法很有必要。本研究采用超高效液相色谱与三重四极杆质谱串联， 建立了一种选择性好、灵敏度高的测定沉积物中对羟基苯甲酸酯的定量方法，具有准确快速等特点，可用于同时测定沉积物中多种对羟基苯甲酸酯。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1290/6460超高效液相色谱—三重四极杆质谱（美国Agilent公司）； UPLC HSS T3色谱柱（美国Waters公司） ； KDC2044低速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）； HZQX160恒温振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）； NDK24W水浴氮吹仪（上海皓庄仪器有限公司）； RE2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； Sartorius BS124S电子天平（德国Sartorius公司）； SPE固相萃取装置（美国Supelco公司）； Oasis MCX柱（60 mg，3 mL，美国Waters公司）； 针孔过滤器（尼龙，孔径0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

对羟基苯甲酸甲酯（MeP）、乙酯（EtP）、丙酯（PrP）、丁酯（BuP）、庚酯（BzP）、苄酯（HeP）以及对羟基苯甲酸（pHB）标准品（美国Accustandard公司）； 内标13C6MeP（纯度为99%，美国剑桥同位素实验室公司）； 甲酸（HPLC级，美国Dikma公司）； 甲醇（HPLC级，美国TEDIA公司）。实验用水为某品牌纯净饮用水。

2.2 实验方法

2.2.1 标准液的配制 准确称取标准物质（包括MeP、EtP、PrP、HeP、BzP和pHB）100.0 mg，用甲醇溶解并定容于25 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为4000 mg/L的标准储备液； 准确称取1.000 g BuP，用甲醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为40000 mg/L的标准储备液。分别取适量标准储备液，用甲醇配制成浓度范围为0.1～500 μg/L的混合标准溶液，于4℃储存备用。

2.2.2 样品的采集 从淮河上游采集沉积物样品，将其放置于不锈钢饭盒中。运回实验室自然风干，研磨， 过70目筛后， 置于棕色广口瓶中避光保存。

2.2.3 样品前处理及方法改进 样品前处理参考文献[16，17]，并将其改进。具体操作步骤如下：称取2 g沉积物于玻璃离心管中，加入5 mL甲醇水（5∶3，V/V）混合溶液后，放入恒温振荡箱中以200 r/min的速度振荡提取60 min，再加入3 mL甲醇水（5∶3，V/V）混合溶液进行二次提取，混合两次提取的上清液，使用氮吹仪氮吹至4 mL，然后用0.2%（V/V）甲酸溶液稀释至10 mL，转移至已用5 mL甲醇和5 mL纯水活化的Oasis MCX固相萃取柱中，用5 mL甲醇洗脱Oasis MCX固相萃取柱，收集洗脱液，旋蒸至近干后用甲醇定容至1 mL，过0.22 μm滤膜并加入内标13C6MeP，用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪进行测定。

3 结果与讨论

3.1 7种目标物质质谱条件的优化

本研究采用超高效液相色谱三重四极杆质谱串联使用实现目标样品的测定，在ESI 模式下分别对目标物质的标准溶液进行母离子扫描，确定其准分子离子并不断优化碰撞电压和碰撞能量，从而确定定量离子与定性离子，最终按照多反应监测模式优化各种质谱参数。质谱参数为：毛细管电压为3500 V， N2作为碰撞气，温度为340℃，流速为11 L/min，喷雾针的压力为275.8 kPa，MS1和MS2的温度均设置为100℃，扫描模式采用多反应检测，优化后的质谱条件如表1所示。endprint

3.2 色谱条件的优化

色谱柱选用UPLC HSS T3柱（100 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），参照文献[16]确定甲醇和0.1%甲酸溶液为流动相，采用梯度洗脱[18]。调节流动相的比例及目标物出峰时间，确定最佳的梯度洗脱条件如表2所示，色谱图如图1所示。 由图1可知，各目标物得到有效分离，并且测定时间控制在10 min内。

3.3 方法的改进

按照参考文献[16，18]的方法对样品进行净化处理，7种目标物质的回收率结果如表3所示。结果表明，7种目标物质回收率在1.22%～133.54%之间，差别较大，只有对羟基苯甲酸甲酯的回收率较高，其余6种目标物质均较低，其中代谢产物对羟基苯甲酸回收率最低，只有1.22%，原因可能是净化步骤中使用水进行淋洗，而pHB的水溶性较强，故在此步骤中容易流失。

为了提高目标物质的回收率，本研究将提取过的样品加入活化好的Oasis MCX柱中后，直接使用甲醇进行洗脱（省略水淋洗步骤），将两次回收率结果进行对比。由表3可知，加标浓度200 ng/g， 除对羟基苯甲酸甲酯的回收率较改进前降低外，其余6种目标物的回收率较改进前均有提高。根据方法改进前后回收率的对比结果可知，改进后的方法更利于对羟基苯甲酸酯及其代谢产物pHB的测定。

3.4 目标物质的线性范围及方法定量限

在优化的色谱及质谱条件下，将配制好的混合标准样品按浓度从低到高的顺序测定进样，以目标组分的峰面积为Y轴，质量浓度（μg/L）为X轴绘制标准曲线，质量浓度在0.1～500.0 μg/L之间线性关系良好，7种目标物质的线性相关系数均大于0.999， 满足实验室的分析要求，方法的线性范围及定量限见表4。

3.6 UPLCMS/MS法与其方法的特征比较

王亮等[19]利用GC/MS测定污水中对羟基苯甲酸酯的回收率为78.3%～127.3%，相对标准偏差4.4%～21.2%，本方法与之相比，回收率略低，但相对标准偏差略优，并且本研究使用UPLCMS/MS不用进行樣品的衍生化，简化了样品的前处理过程； 国标法[20，21]中使用高效液相色谱法紫外检测器对对羟基苯甲酸酯盐类的含量进行测定，但紫外检测器的灵敏度相对较低，较难测定低含量的样品；而UPLCMS/MS的高灵敏度使其可用于测定低含量的对羟基苯甲酸酯。

3.7 实际样品的分析

应用本方法测定了 2014 年4 月采集的淮河南段表层沉积物中对羟基苯甲酸酯类及其代谢产物的含量。由表6可知， 河段沉积物中共检出5种目标物，BzP和HeP未检出。5种检出目标物中， pHB的含量最高， 达到36.5～271 ng/g， EtP的含量较低，为0.90～2.69 ng/g。

References

1 REN Lu， FANG JianZhang， LONG Fei， LU Ping， LIU GuiHua， ZHANG JianQing， LU ShaoYou. Asian J. Ecotoxicol.， 2016， 11（1）： 261-267

任 璐， 方建章， 龙 飞， 卢 平， 刘桂华， 张建清， 陆少游. 生态毒理学报， 2016， 11（1）： 261-267

2 ZHOU JianKe， SONG Ge， LIU RuiYing， ZHANG MingCui. J. Hebei Univ.（Nat. Sci. Ed.）， 2010， 30（4）： 385-389

周建科， 宋 歌， 刘瑞英， 张明翠. 河北大学学报（自然科学版）， 2010， 30（4）： 385-389

3 Darbre P D， Aljarrah A， Miller W R， Coldham N G， Sauer M J， Pope G S. J. Appl. Toxicol.， 2004， 24（1）： 5-13

4 Soni M G， Carabin I G， Burdock G A. Food Chem. Toxicol.， 2005， 43（7）： 985-1015

5 Darbre P D， Harvey P W. J. Aappl. Toxicol.， 2008， 28（5）： 561-578

6 Crinnion W J. Altern. Med. Rev.， 2010， 15（3）： 190-196

7 National Food Safety Standard for Uses of Food Additives. National Standards of the People′s Republic of China. GB/T 203882006

食品安全国家标准 食品添加剂使用标准， 中华人民共和国国家标准. GB/T 27602011

8 Safety and Technical Standards for Cosmetics. State Food and Drug Administration（2015）

化妆品安全技术规范， 国家食品药品监督管理总局（2015年版）

9 LIU Hui， XU Cheng， LIU Qian， GU AiHua. J. Hyg. Res.， 2016， 45（1）： 155-158

刘 慧， 徐 诚， 刘 倩， 顾爱华. 卫生研究， 2016， 45（1）： 155-158

10 Nunez L， Tadeo J L， GarciaValcarcel A I， Turiel E. J. Chromatogr. A， 2008， 1214： 178-182endprint

11 ZHU LingYan， LIU NanNan， DENG BaoLe. Chinese J. Appl. Ecol.， 2009， 20（10）： 2574-2580

祝凌燕， 劉楠楠， 邓保乐. 应用生态学报， 2009， 20（10）： 2574-2580

12 SHEN Juan， ZHANG HaiYan， CHU ChengDing， REN LingLing， LIANG ChunMei. Chinese J. Anal. Lab.， 2013， 32（11）： 88-92

沈 娟， 张海燕， 储成顶， 任玲玲， 梁春梅. 分析试验室， 2013， 32（11）： 88-92

13 CAO ShuRui， LIU ZhiYong， ZHANG Lei， LI XianLiang， WANG GuoMin， TANG BoBin， YUAN Ruo. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（4）： 529-533

曹淑瑞， 刘治勇， 张 雷， 李贤良， 王国民， 唐柏彬， 袁 若. 分析化学， 2012， 40（4）： 529-533

14 BAO ZhongDing， XU RongFei， XU RongNian， GU XiuYing. Chinese J. Anal. Chem.， 2004， 32（2）： 270

鲍忠定， 许佳飞， 许荣年， 顾秀英. 分析化学， 2004， 32（2）： 270

15 ZHANG QunLin， LIU Yi， LI Jun， CHEN YuanZhu. Anhui Med. Pharmaceut. J.， 2006， 10（4）： 241-244

张群林， 刘 毅， 李 俊， 陈元柱. 安徽医药， 2006， 10（4）： 241-244

16 Gatidou G， Thomaidis N S， Stasinakis A S， Lekkas T D. J. Chromatogr. A， 2007， 1138： 32-41

17 Liao C Y， Lee S， Moon H B， Yamashita N， Kannan K. Environ. Sci. Technol.， 2013， 47： 10895-10902

18 WANG Juan， FAN BiWei， XU ShuXia. Food Sci.， 2008， 29（7）： 328-331

汪 隽， 范必威， 许淑霞. 食品科学， 2008， 29（7）： 328-331

19 WANG Liang， MAO QianHui， YUAN ShouJun， HUANG DeYing， ZHANG JiDe. Environ. Chem.， 2016， 35（1）： 49-56

王 亮， 毛茜慧， 袁守军， 黄德英， 张继德. 环境化学， 2016， 35（1）： 49-56

20 National Food Safety Standard for Food Additives： Methylparaben Sodium. National Standards of the People′s Republic of China. GB 306012014

食品安全国家标准 食品添加剂 对羟基苯甲酸甲酯钠. 中华人民共和国国家标准. GB 306012014

21 National Food Safety Standard for Food Additives： Ethylparaben Sodium. National Standards of the People′s Republic of China. GB 306022014

食品安全国家标准 食品添加剂 对羟基苯甲酸乙酯钠. 中华人民共和国国家标准. GB 306022014

Abstract A new method for simultaneous determination of six benzoic acid esters and their metabolite phydroxybenzoic acid （pHB） in sediments was developed. The samples were extracted with methanol and water， and then the extraction was purified by Oasis MCX solid phase column. The separation of targets was conducted by passing through a UPLC HSS T3 column with a methanol0.1% acid aqueous solution as the mobile phase under gradient elution. The qualitative analysis of the analytes was measured by Ultra performance liquid chromatographyTriple quadrupole tandem mass under multiple reaction monitoring mode （MRM） and the internal standard method was applied for quantitative analysis. The results indicated that seven target substances had a good linear relationship in the range of 0.1-500 μg/L with correlation coefficients above 0.9995 and the detection limits of 0.75-1.23 ng/g. The recoveries ranged from 65.5% to 88.3% and the relative standard deviation was 74%-136%. This method was suitable for the measurement of benzoic acid esters with the advantages such as simple processing， good selectivity and high sensitivity.

Keywords Ultra performance liquid chromatographytriple quadrupole tandem mass spectrometry； Benzoic acid esters； Sediment

（Received 25 May 2017； accepted 10 October 2017）endprint