基于空间阻滞的新型高灵敏电化学传感器检测三磷酸腺苷的研究

邵爽

摘 要 构建了检测ATP的新型高灵敏电化学传感器，采用扫描电镜、荧光显微镜成像技术、微分脉冲伏安法及电化学阻抗法进行表征。传感器以硅纳米颗粒通过多段DNA链与氧化铝纳米孔膜形成的三明治结构阻碍离子传导， ATP存在下，传感器中的三明治结构被破坏，使离子通道顺畅，通过检测其电流变化值达到检测目标物ATP的目的。硅纳米颗粒的应用提高了检测灵敏度，降低了背景信号；而且仅需极少量的样品即可实现对ATP的检测。结果表明，此传感器对ATP检测的线性范围为0.025～0.900 nmol/L，检出限为13 pmol/L（S/N=3）。当样品中有100倍目标物浓度的共存物质存在时，传感器仍显示出对ATP的高特异性。此传感器构建简单，再生性好，可实现对小鼠血液中痕量ATP的检测，有望应用于临床医学检测、医药工业和环境检测等领域。

关键词 三磷酸腺苷； 氧化铝纳米孔膜； 硅纳米颗粒； 生物传感器

1 引 言

三磷酸腺苷（Adenoine triphosphate， ATP）是一種多用途化学信号传导剂，在生命体的信号转导也起着中心作用。此外ATP在环境监测、药物分析以及生命科学等领域也具有重要作用[1～3]。目前，检测ATP的方法主要有比色法[4，5]、液相色谱法[6]、荧光分析法[7～9]、化学发光法[10]和电化学方法[11]等。Liu等[12]利用硫磺素（ThT）的荧光增敏效应设计了可灵敏检测ATP的方法，Chen等[13]利用纳米金聚集性能建立了测定ATP的比色方法。在目前所使用的方法中，实验操作繁杂、所用试剂制备困难、需要昂贵的仪器等缺点限制了方法应用。近年来，纳米孔作为一种能与适配体联用并具有智能响应的纳米器件在生物分析领域引起了广泛关注，在提高检测方法的灵敏度及特异性方面有显著优势。

本研究将具有高特异性的适体与具有智能响应的氧化铝纳米孔膜（PAA）相结合构建生物传感器，实现了对小鼠血液样品中痕量ATP的高灵敏、高选择性检测。传感器工作原理如图1所示，首先，在PAA孔道内修饰能与ATP适体（H4）3′端部分互补的核苷酸链（H1），在二氧化硅纳米粒子（SiO2NPs）上修饰可与H4链5′端部分互补的核苷酸链（H2）。在H4存在下，PAA/H1和H2/SiO2NP可在PAA孔道内形成具有三明治结构的PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs复合体。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI832电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）； IX51奥林巴斯倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）。氧化铝纳米孔膜（PAA， 直径25 mm，厚度为60 μm，孔径为200 nm，上海上木科技有限公司）。3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、三氯乙酸（TCA）、三磷酸腺苷（ATP）、胞苷三磷酸（CTP）、三磷酸鸟苷（GTP）、三磷酸尿苷（UTP）、二磷酸腺苷（ADP）和腺苷单磷酸（AMP）等购于国药集团有限公司（上海）。核苷酸序列：H1：5′NH2TTTT TTTTTTTTTTTCTTCCTCCGC3′，H2：5′ACTCCCCC AGTTTTTTTTTTNH23′， H3：5′6（FAM）ACTCCCCC AGTTTTTTTTTTNH23′，ATP适体 H4：5′CTGGGGG AGTATTGCGGAGGAAG3′，均经HPLC纯化并由上海生工有限公司合成。所用试剂均为分析纯，TrisHCl缓冲液（15 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2和10 mmol/L TrisHCl， pH=7.4），实验用水均为超纯水（超纯水仪，上海纯浦实业有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 H2/SiO2NPs的合成 单分散性的二氧硅纳米粒子（SiO2NPs）采用文献[14]的溶胶凝胶法合成，浓度约0.5 g/L。 在5 mL SiO2NPs乙醇分散液中加入60 μL APTES、 5 mL 1.05%丁二酸酐DMF溶液，室温搅拌24 h后，悬浮于10% DMSO pH 7.4缓冲液中，加入6.0 nmol H2或H3、 0.02 g EDC，37℃水浴中振荡过夜，离心、洗涤，分散于200 μL TrisHCl缓冲液，浓度约为0.25 g/L。

2.2.2 PAA/H1修饰电极的制备 PAA电极浸入含有25%APTES的丙酮溶液，持续5 h，乙醇和水交替冲洗后，置于2.5%戊二醛溶液中，避光孵育过夜；洗涤后浸入1 mL含100 nmol/L H1、 0.1 g EDC和25% DIPEA 的TrisHCl缓冲液中， 37℃恒温振荡孵育过夜，取出后用TrisHCl缓冲液洗涤， 除去游离的H1， 得到H1修饰的PAA电极。

2.2.3 PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs传感器的制备 将上述PAA/H1置于1 mL含100 nmol/L H4， 0.025 g/L H2/SiO2NPs TrisHCl缓冲液中， 37℃下孵育1 h，洗涤后，于4℃、饱和湿度下保存，备用。

2.2.4 小鼠血样中ATP的测定 参照文献[16，17]进行血样预处理：取30 μL SD大鼠新鲜血液，稀释1倍， 加入6 μL 4.9 mol/L三氯乙酸（TCA）溶液破坏血红细胞壁释放ATP，再加入24 μL TrisHCl缓冲液， 使最终体积为90 μL， 混匀， 在冰浴中反应5 min。2500 r/min离心5 min，取30 μL上清液滴加到传感器表面，于37℃下密闭孵育1 h，传感器用TrisHCl缓冲液清洗后， 再置于4.0×10 4 mol/L K3Fe（CN）6溶液中，在0～0.4 V范围做微分脉冲伏安扫描（DPV），记录扫描氧化峰电流值。

3 结果与讨论

3.1 H2/SiO2NPs的表征

SiO2NPs呈球形， 并显示出良好的单分散性，其直径约40 nm（图2A）。荧光显微镜观察FAMH3至SiO2NPs表面修饰情况见图2B和2C，只有纳米粒子表面才有绿色荧光出现，表明硅纳米粒子表面成功修饰了DNA链。endprint

3.2 传感器的电镜表征

PAA孔径约200 nm，表面较光滑（图2D），当 PAA修饰H1链时，PAA纳米孔壁及周围变得粗糙（图2E），表明H1修饰到PAA纳米孔内壁；进一步修饰H2/SiO2NPs后，PAA纳米孔内及其周围区域都覆盖有准圆形颗粒（图2F），证明H2/SiO2NPs成功修饰到PAA膜纳米孔内壁，形成了 PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs三明治结构， 可堵塞PAA通道。

电极表面修饰PAA后，其阻抗图中高频区的半圆直径（大小相当于电子转移阻抗Ret）很小（图3B），依次在PAA膜孔内壁修饰氨基、羧基、H1链及形成PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs三明治复合物后，Ret逐渐增加，这是由于空间位阻效应及电子排斥效应导致，上述结果再次表明传感器成功层层组装和修饰。

传感器置于适量ATP溶液孵育后，将剩余ATP量的对数值与培育时间作图可得一条直线（图3C）。95%置信度时，其直线方程为lnCATP = 0.0257t （min）-3.790（R2=0.9763），呈一级反应性质。这是因为与PAA通道内的三明治PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs复合物相比，加入的目标物ATP 量很少，因此 ATP与SiO2NP三明治复合物的反应表现为准一级反应，通过计算可得此置换反应的速率常数k=4.28×10，说明其反应速度可以满足快速检测ATP的需求。

3.5 传感器特异性和再生性实验

传感器的选择性实验结果如图4A所示。当CTP、GTP、UTP、ADP和AMP的浓度分别是ATP浓度的100倍时，传感器的电化学响应信号很低；只有当ATP存在或样品中同时含有ATP时，其电化学响应增大。说明此传感器可实现对ATP的特异性检测。

由于传感器的组装和修饰步骤比较繁杂，传感器的重复利用有利于降低成本。对传感器的再生性能做了研究。即检测ATP后，传感器为PAA/H1状态，可继续与H2/SiO2NPS及H4作用，使之形成完整的三明治结构复合体（PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs），回到传感器初始状态，可再重复进行ATP检测操作。实验结果见图4B，传感器在检测再生的8次循环使用中，其电化学信号呈周期性变化，检测电流改变值小于10%。因此，所制备的传感器具有良好的再生性。

3.6 传感器对ATP的检测性能

在最佳实验条件下，在传感器表面分别滴加30 μL不同浓度的 ATP溶液，密闭孵育后的检测结果如图5A所示。在0.025～0.900 nmol/L范围内，检测信号与ATP浓度之间呈现良好的线性关系，线性方程为y（μA）=0.331CATP （nmol/L） +0.0110（R2=0.9917），检出限为13 pmol/L（S/N=3）。由于测定时所需样品溶液体积仅为30 μL，因此最低检测量仅为2.2 pg，表明此传感器所用样品量少，灵敏度高。

3.7 生物样品中ATP检测

为验证此ATP传感器在检测生物实际样品中ATP的实用性，检测了稀释的SD大鼠全血样品、TCA處理后的SD大鼠全血稀释样和SD大鼠血浆稀释样中的ATP，结果见表1。在血浆稀释样和全血稀释样中都未检出ATP，仅在TCA处理后的全血稀释液中检测出ATP，通过计算可得原SD大鼠血样中ATP 浓度为0.43 nmol/L，加标回收率在94.5%～105.8%范围内，表明本传感器可满足实际样品的检测要求。

4 结 论

基于空间阻滞构建了新型生物传感器，成功实现了对ATP的灵敏/高效检测。采用硅纳米粒子和氧化铝纳米孔膜组成的三明治结构，最大限度地调控PAA膜纳米通道内的离子移动性能，有效降低传感器背景信号及检测用量，检出限达到13 pmol/L，并且所需的样品量极少（30 μL），可极大地提高检测灵敏度。传感器还具有良好的再生性能，可降低使用成本。传感器可实现生物样品中ATP的检测，回收率均在94.5%～105.8%范围内，表明方法检测的准确性高。此传感器有望在临床医学、医药工业和环境检测等领域应用。

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Abstract In this work， a highly sensitive electrochemical biosensor for the detection of trace adenosine triphosphate （ATP） was proposed. The biosensor was based on porous anodic alumina （PAA） and SiO2 nanoparticles combining with several oligonucleotides to construct sandwich structure. It was characterized by scanning electron microscopy， fluorescence microscopy， differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy， which conformed to the reliability of the biosensor fabrication and the feasibility of the detection. In the presence of ATP， the sandwich structures could be destroyed. The variation of the current was directly corresponding to the amount of the ATP. The application of SiO2 nanoparticles could effectively reduce the background and increase the sensitivity of the biosensor. The calibration curve of ATP was obtained in the range of 0.025-0.900 nmol/L with the detection limit of 13 pmol/L （S/N=3）. Also， the biosensor exhibited a good specificity. Besides， the sensor was constructed easily and possessed excellent regeneration ability. The proposed biosensor was applied in detection of real sample such as mice blood. Therefore， the proposed ATPsensing biosensor could be expected to be applied in clinical， pharmaceutical and environmental detection.

Keywords Adenosine triphosphate； Porous anodic alumina； Silicon dioxide nanoparticles； Biosensors

（Received 2 November 2017； accepted 8 December 2017）

This work was supported by the Nation Key Foundation for Exploring Scientific Instrument （No.2011YQ150078）， the Science and Technology Commission of Shanghai （No.15142200600）， and the National Natural Science Foundation of China （No.21575024）.endprint