基于单壁碳纳米管阵列的克伦特罗无酶传感器研究

刘佳+秦怡

摘 要 采用循环伏安法（CV）将单壁碳纳米管（SWCNTs）键合在玻碳电极上，制备单壁碳纳米管阵列（vSWCNT）修饰电极。羧基化碳纳米管以乙二胺（EDA）为桥梁，形成酰胺键， 使碳纳米管在玻碳电极（GCE）上有序稳定排布。制备的vSWCNT电极稳定性好，对盐酸克伦特罗（CLE）的检测灵敏度高。实验结果表明，碳纳米管有规则的链接方式提高了利用效率。有序键合在电极表面的的碳纳米管，因其良好的加速电子转移作用、纳米催化效应及吸附作用，检测CLE的峰电流较GCE提高了一个数量级以上。CLE浓度在10～120 ng/mL范围内与电极的响应电流呈良好的线性关系。此电极用于人尿液中CLE的检测，结果令人满意。本研究制备的单壁碳纳米管阵列电极作为新型高灵敏CLE电化学无酶传感器，可望进一步开发用于实际临床检测。

关键词 循环伏安法；盐酸克伦特罗；碳纳米管；单壁碳纳米管阵列

1 引 言

盐酸克伦特罗（Clenbuterol hydrochloride，CLE）作为典型的β受体兴奋剂[1]，通常用于治疗支气管哮喘及抑郁症[2]。因其可促进蛋白质合成和加快动物生长速度，CLE被非法添加于饲料中的事件时有发生。CLE被动物吸收后，可残留在肉及肝脏内部，且半衰期长。通过食物链被人体摄入的CLE过多，可引起心血管及中枢神经系统的相关疾病[3]。因此，食品中的CLE残留分析至关重要。目前，CLE的分析检测方法主要包括色谱、质谱、毛细管电泳及免疫分析，这些方法通常需要昂贵的仪器、繁琐的前处理工作、特定的环境或测定条件，不利于CLE的快速、实时检测和监管需求。

由于CLE中存在电活性的芳香基团，可以采用电化学方法进行分析检测[4]。电化学传感器以其灵敏度高、操作方便、检测经济廉价而备受关注[5～8]。通过使用具有优良的导电和催化性能的新型材料，构建可加速电子转移以及具有良好催化性质的修饰表面，可促进被检测生物小分子的氧化还原反应，提高电极界面的电催化活性及选择性[9，10]。

碳纳米管（CNTs）以其优越的电催化活性及生物相容性在生物传感器领域中得到了广泛应用[11～13]。CNTs修飾电极在CLE检测方面具有独特优势。首先，碳纳米管具有高的比表面积及大π键，CLE的苯环易与碳管表面形成ππ共轭键而促进电子在物质与界面的传递，加速CLE的氧化还原。其次，CNTs上的缺陷形成的羧基键（COOH）与CLE的胺基键（NH2）之间的静电作用，加速了CLE与电极之间电子传递。目前的文献研究主要以CNTs与导电聚合物膜、导电纳米金属粒子或金属氧化物混合，采用物理滴涂法制备传感器界面，这种混合物的界面排列无序，催化位点不能有效利用。提升CNTs的表面位点的利用效率，CNTs的有序排布是关键。

相比于无序排列的碳纳米管，有序排列的碳纳米管可以改善表面的电化学性能及空间性能[14，15]，形成竖直取向的单壁碳纳米管阵列，用来制备修饰电极，已成为目前研究的热点。本研究使用循环伏安法，以乙二胺为桥梁，制备有序排布的单壁碳纳粹管（vSWCNTs）修饰电极，利用vSWCNTs在电极界面的有序性排列，及末端丰富的羧基基团，实现对CLE的检测。单壁碳纳米管的有序排列使得碳纳米管缺陷边缘的羧基更加裸露在修饰电极外侧，羧基峰电流明显增大。羧基对CLE的胺基有弱吸附作用，CLE的加入导致羧基峰电流加大。对于同浓度的CLE，vSWCNTs/EDA/GCE 的响应电流是GCE的16.1倍。 对10～120 ng/mL CLE， 修饰电极的羧基峰电流的增加与CLE浓度呈良好的线性关系，R2>0.995。以电化学制备的vSWCNTs/EDA/GCE检测CLE的稳定性好、灵敏度高。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI420A型电化学工作站（上海辰华仪器公司）；三电极系统：玻碳电极为工作电极，饱合甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

盐酸克伦特罗250 μg/mL，（上海玉博生物科技有限公司）； 羧基化单壁碳纳米管（≥95%， 直径1～2 nm， 美国SigmaAldrich）；实验中使用的溶液包括：250 μg/mL盐酸克伦特罗、羧基化单壁碳纳米管溶液 （2 mg SWCNTs 加入到5 mL 0.1 mol/L KCl溶液）、0.25 mol/L H2SO4溶液、重铬酸钾溶液（2.5% K2Cr2O7+10% HNO3）、乙二胺（EDA）溶液（5 mmol/L 乙二胺+0.1 mol/L KCl）、单壁碳纳米管溶液（2 mg SWCNTs加入到5 mL 0.1 mol/L KNO3 中）。硫酸盐缓冲溶液（pH 1～2）、0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 3～8）；电化学测定的电解质溶液为0.05 mmol/L K3Fe（CN）6+0.1 mol/L KCl）。以上试剂均为分析纯。

2.2 vSWCNT/EDA/GCE 电极的制备

vSWCNT/EDA/GCE电极制备过程如图1所示： （1）电极预处理 依次用0.3 mm和 0.05 mm Al2O3抛光玻碳电极，分别用HNO3溶液（1∶1，V/V）、去离子水超声2～3 min；此后在0.25 mol/L H2SO4溶液中，用循环伏安法（CV， 1.0～1.0 V）扫描处理。用去离子水清洗干净，在铁氰化钾溶液中 0.2～0.6 V循环伏安扫描，直至氧化峰与还原峰的电势差ΔE<64 mV。（2）重铬酸钾氧化电极 在2.5%重铬酸钾溶液中，用循环伏安法对处理好的GCE电极进行扫描（0 ～2.0 V）1～20个周期。（3）乙二胺酰胺化 将重铬酸钾氧化的GCE置于入5 mL乙二胺溶液中，以CV法（0～2.0 V）扫描5、10、15、20和25个周期，获得EDA/GCE。（4）单壁碳纳米管阵列的制备 将单壁碳纳米管溶液超声处理3～6 min，使其分散均匀，取5 mL放入反应池中， 在高纯氮气保护下，将EDA/GCE电极用CV法（0～2.0 V）扫描5、10、15、20和25圈。endprint

3 结果与讨论

3.1 修饰电极的表征

对GCE、EDA/GCE、vSWCNT/EDA/GCE的电化学催化性能进行比较，结果如图2所示。结果表明，在pH 1.0的溶液中检测16 μg/mL CLE时，EDA/GCE电极上CLE的响应电流是GCE的4.2倍，这可能是基于电极表面乙二胺上胺基与CLE分子中的羧基之间的静电吸引作用，促进CLE的氧化还原，也说明CV法能使乙二胺有效键合在GCE。 vSWCNT/EDA/GCE的CLE峰电流进一步增加，是EDA/GCE检测电流的3.9倍，是GCE的16.1倍。此结果得益于表面键合碳纳米管的优良导电性能及催化性能。以CV法制备的vSWCNT/EDA/GCE，是以酰胺键键合单层有序排列的单壁碳纳米管阵列，相比物理粘合法制备的碳管电极，电极表面的碳管修饰量明显下降，但碳管的有序排列，使其活性催化位点能够充分暴露，所以检测CLE时呈现强的电化学响应信号。

裸电极修饰上乙二胺及碳纳米管后，电极表面的颜色发生了变化。裸电极呈金属银颜色（图3A），修饰乙二胺后，电极表面呈暗黄色（图3B），而碳纳米管与乙二胺交联后vSWCNT/EDA/GCE电极表面呈现宝蓝色金属光泽（图3C）。当不采用乙二胺电化学修饰步骤，直接尝试将铬酸氧化后的GCE连接羧化碳纳米管，电极表面不呈现宝蓝色金属光泽。此结果也证明了乙二胺与碳纳米管已逐步修饰到电极上，乙二胺起到了桥梁的作用。也进一步证明采用CV法制备了酰胺键联接的单层碳纳米管阵列。

3.2 盐酸克伦特罗的检测

CLE的检测该选择强酸性环境，但考虑电极表面链接碳纳米管与GCE的酰胺键基团在强酸条件容易被水解，因此考察了了电极的稳定性。结果表明，vSWCNTs/EDA/GCE在pH=1的条件下进行CLE检测，能够稳定使用1个月以上，电极性能没有明显下降。因此，选择pH=1作为最佳检测pH值。

3.2.3 修饰电极制备条件优化 电极修饰界面修饰的羧基化碳纳米管具有加速电极表面电子传递作用，因此，碳纳米管阵列的修饰量非常关键。首先，采用重铬酸钾对玻碳电极进行氧化，形成丰富的羧基官能团。氧化剂的用量及氧化时间是影响电极性能的重要条件，氧化不足，表面的羧基位点少，形成的检测位点少，从而影响物质检测的灵敏度；氧化过量，导致电极表面形成部分缺陷，同样降低检测位点。固定重铬酸钾浓度为2.5%（w/w），氧化数量的多少与电极的扫描圈数成正比。如图6A所示，随扫描圈数的增加，CLE的检测峰电流先不断上升，扫描5圈时，CLE的峰电流反而下降，表明氧化过度导致电极界面的有效作用位点减少。因此，选择重铬酸钾溶液氧化的最佳扫描圈数为4圈。

电极被氧化后，与乙二胺在循环伏安法下进行反应，将乙二胺连接在电极表面。随着在乙二胺溶液中的扫描圈数的增加，CLE的峰电流不断增大（图6B）。增至25圈时，CLE的峰没有明显增加。此外，乙二胺扫描圈数增加，所键合的碳管羧基峰电位正移（0.25 V），CLE检出电位（0.40 V）接近，与CLE氧化峰部分重合（图6C）。为了避免两者电流的互相影响，乙二胺溶液的最佳优化周期数定为20个循环。

将单壁碳纳米管阵列键合在乙二胺修饰的电极上，随着扫描圈数增加，峰电流增大（图6D），但至25圈时，CLE峰电流较20圈上升很小。主要原因是扫描圈数越多，酰胺化反應几率越大，直至反应饱和，增大反应的圈数不能再促进反应。但随着键合周期增加，电极表面羧基峰正移。键合25圈后，修饰电极的羧基峰与CLE的氧化峰部分重叠。为了避免两者相互干扰，选择CV扫描20圈数进行碳纳米管阵列的电化学合成。

3.3 vSWCNTs/EDA/GCE电极检测CLE的分析性能

在最佳实验条件下制备的vSWCNTs/EDA/GCE电极，采用SWV法在pH 1体系中检测CLE，修饰电极在0.42 V处有一对氧化还原峰，对CLE的检出限为1.0 ng/m L（S/N=3）。随着CLE浓度的增大，峰电流不断增加。特别对低浓度范围的CLE，峰电流增加与CLE浓度呈良好的线性关系。如图7所示， 在10～120 ng/mL的CLE浓度范围内，碳纳米管羧基峰电流的增加与CLE的浓度呈良好的线性关系， 线性方程为y=0.263x+16.924，线性相关系数R2=0.995。表1比较了已报道的CLE无酶电化学传感器检测性能。基于碳管表面的大π键与CLE的苯环之间的共轭作用，及碳管有序排列后，修饰表面丰富的羧基官能团与CLE胺基官能团之间的静电吸引作用，促进了CLE在电极表面的富集，进一步促进氧化还原反应的进行。此外，修饰层与电极界面以化学键结合，相比物理粘附，性能更稳定。因此，电化学方法键合所得的vSWCNTs/EDA/GCE可作为高灵敏、高稳定性的CLE传感器。制备的碳纳米管修饰电极稳定性好，修饰层不易脱落。修饰好的电极在4℃放置一个月后，对CLE检测的峰电流几乎不变。

3.4 人尿样中CLE的检测

在人尿样品中添加不同浓度水平的CLE，采用本方法进行检测。如表2所示，加标回收率为101%～103%， 在人尿样中含有大量的尿酸和蛋白质等共存物质，并不影响对CLE的检测。

4 结 论

本研究通过氧化玻碳电极使其表面生成羧基，与乙二胺形成酰胺键，再采用循环伏安法将羧基化单壁碳纳米管阵列键合到GCE上，从而在电极表面有顺序地形成单层SWCNT阵列。有序的碳纳米管阵列具有高纵横比、高催化活性及优良的导电性能。通过碳纳米管表面羧基与CLE胺基之间静电作用，促使碳管表面羧基峰电流增加。基于羧基峰电流增加与CLE浓度的线性关系，制得高灵敏CLE传感器。在pH 1的缓冲液中，以SWV法进行CLE检测，在人尿样加标回收实验结果良好。

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Abstract Vertical singlewalled carbon nanotubes （vSWCNTs） array was constructed on glassy carbon electrode （GCE） by electrochemical method of electrocyclic voltammetry （CV method）. The synthesized electrode was very stable and was not easy to fall off. Via the amino groups of ethylenediamine （Ethylenediamine， EDA） and the carboxyl group of carboxylated carbon nanotubes， the SWCNTs were ordered to grow steadily on GCE（vSWCNTs/EDA/GCE）. The modified electrode was used to detect hydrochloric acid clenbuterol （CLE）. The experimental results showed that the regular link of carbon nanotubes on GCE improved its utilization efficiency. The detection sensitivity of clenbuterol was 16.1 times higher than that of the bare GCE. Due to electron accelerating effect and nanometer effect of SWCNTs， the carboxyl peak current of SWCNTs was increased with the added CLE. The carboxyl peak current of SWCNTs had a good linear relationship with CLE concentration in the range of 10-120 ng/mL. The method was successfully applied to the determination of CLE in real urine samples with good recoveries. Also vSWCNTs/EDA/GCE could be used as a new highly sensitive electrochemical sensor for CLE detection.

Keywords Cyclic voltammetry； Clenbuterol； Carbon nanotubes； Vertical singlewalled carbon nanotubes array

（Received 25 October 2017； accepted 11 December 2017）endprint