基于聚合酶辅助信号放大的电化学发光DNA传感器研究

张蒙

摘 要 构建一种新型基于聚合酶辅助电致化学发光DNA传感器，利用循环链置换聚合反应、 辅助目标mRNA循环以及量子点的信号放大，实现超灵敏检测目标mRNA。将巯基修饰的发卡型捕获探针（Capture DNA，CP）通过AuS键组装到Fe3O4@Au表面，并通过磁性组装到磁控玻碳电极上。目标mRNA存在時，目标mRNA打开发卡CP，与之杂交形成dsDNA； 然后加入聚合酶、 引物链（DNA1）及碱基，引物链开始扩增，将目标mRNA取代，释放的目标mRNA重新结合CP，引发下一轮扩增循环，使信号循环放大，最后加入TGACdTe量子点标记的DNA2，与打开后的CP末端序列通过碱基互补配对结合，进行电化学发光检测。在1×10 15～1×10 11 mol/L范围内，目标mRNA浓度的对数与ECL信号呈良好的线性关系，检出限为3.4 × 10 16 mol/L。人体血清样加标回收率为97.2%～102.3%。本方法通过加入聚合酶使目标mRNA循环检测以及结合量子点标记的信号放大协同提高了检测的灵敏度。结果表明，此传感器具有良好的选择性、 稳定性和重现性。

关键词 DNA传感器； 聚合酶； 目标物循环； 信号放大； 电化学发光

1 引 言

近年来，由于环境污染以及日常生活中不良习惯的影响，癌症的发病率逐渐增高，严重危害人类健康[1]。早期诊断是提高癌症患者治愈率和生存率的关键[2]。研究发现，mRNA 表达与多种类型的肿瘤密切相关，不仅可以作为诊断的生物标志物，也可以作为潜在的治疗靶点[3，4]。因此对癌症mRNA的检测分析已经成为目前临床诊断和疾病治疗的重要参考和依据。

目前检测mRNA有多种方法。RNA印记法[5]是传统的mRNA分析方法，但是耗时长、 灵敏度低、 过程繁琐。为了克服这些缺点，研究者开发了许多新方法，包括微阵列分析[6，7]、 荧光法[8]、 PTPCR[9]、 等温指数放大法[10]、 分子信标法[11]等。然而，这些方法分析成本较高、 操作程序复杂，灵敏度仍需进一步提高。相比之下，电化学传感器作为选择性好、 成本低、 准确度高、 快速简便的检测手段已成为目前mRNA检测的研究热点之一[12，13]。

在利用DNA电化学传感器进行检测时，为提高灵敏度，常采用扩增放大目标物和增强检测信号等方法。前者如聚合酶链式反应（PCR）[14]、 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）[15]等。通过目标物扩增的信号放大技术是目前提高检测灵敏度常采用的方法[16～20]。而采用DNA“三明治”杂交结构[21]和量子点[22，23]等为典型的增强检测信号放大策略。

电化学发光由于具有灵敏度高，特异性好，发光易于控制等优点，已经成为临床诊断中最有前景的方法之一。量子点因其高效及稳定的电化学发光性能被作为发光标记物广泛用于电化学发光分析中。本研究引入酶放大技术[24～27]， 利用DNA聚合酶的扩增反应引导目标物循环辅助信号放大，并结合量子点增强电化学发光信号，实现了对目标物的高灵敏检测，建立了一种基于聚合酶电化学发光DNA传感器检测mRNA的新方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

MPIE型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）； PGSTAT128N Autolab电化学工作站（瑞士万通有限公司）； AL204型电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）； 磁控玻碳电极（d=3 mm）； CHI660D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）。

1乙基33二甲基氨丙基碳化二亚胺（EDC）、 N羟基琥珀酰亚胺（NHS）、 巯基己醇（MCH）， 均购自浙江普康化工有限公司。K3Fe（CN）6、 NaOH、 NaCl、 KCl、 CdCl2·2.5H2O、 K2S2O8、 Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O，均购自西陇化工股份有限公司。三（2羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）、 巯基乙酸（TGA），均购自上海安妍生物有限公司。FeSO4·7H2O、 FeCl3·6H2O，购自郑州四季化工产品有限公司。碲粉（Te）、 硼氢化钠（NaBH4）、 氯金酸（HAuCl4）、 柠檬酸钠，均购自国药集团化学试剂有限公司。0.2 mol/L PBS缓冲液（pH=7.4）。所用试剂均为分析纯，溶液均用二次蒸馏水配制。碱基序列、 Klenow Fragment聚合酶、 酶反应缓冲液和脱氧核糖核酸混合液（dNTP Mix），均购于上海生工生物工程公司。所使用的碱基序列如表1所示。

2.2 实验方法

2.2.1 核壳型磁性纳米粒子Fe3O4@Au的制备 Fe3O4@Au纳米微粒的合成参照文献[28＼]的方法并稍作改进。称取0.67 g FeSO4·7H2O和1.14 g FeCl3·6H2O，用水溶解并定容至250 mL。将溶解后的混合溶液倒入通有氮气的三口烧瓶内（始终通氮气保护），在50℃水浴中，迅速加入2 mol/L NaOH溶液调节溶液至pH≈10，期间不断搅拌并持续通氮气1.5 h。将温度调至80℃，每隔5 min测量pH值，确保溶液中的pH值稳定，加热熟化磁性纳米粒子25 min。冷却至室温，通过磁铁进行磁性分离，每隔30 min用二次蒸馏水洗涤一次，直到溶液呈中性，配成5 mg/L Fe3O4溶液，4℃贮存备用。

称取0.229 g柠檬酸钠溶解在100 mL水中，倒入三口烧瓶并在机械搅拌下加热至99℃，迅速加入1 mL 上述制备的磁性Fe3O4纳米粒子和1 mL 1 g/mL HAuCl4溶液，恒温搅拌15 min。移去热源，继续搅拌15 min，得到酒红色溶液，冷却至室温后，通过磁铁进行磁性分离。用水洗涤至溶液为中性，并用水定容至20 mL，得到0.25 mg/L Fe3O4@Au贮备液， 4℃保存备用。endprint

2.2.2 水溶性CdTe量子點的制备 参照文献[29＼]中TGACdTe量子点合成方法，稍作改进。准确移取4 mL水于100 mL 三颈瓶中，通入氮气除氧10 min，加入0.360 g NaBH4和0.144 g Te粉，在65℃水浴下磁力搅拌反应20 min，直至黑色Te粉完全消失，得到紫色透明0.2 mol/L NaHTe溶液。

配制250 mL 0.0025 mol/L CdCl2溶液，加入到500 mL三口圆底烧瓶中，通氮气除氧15 min，加入100 μL巯基乙酸，用NaOH调至pH≈10。继续通氮气除氧10 min并持续强磁力搅拌。加入上述制备的0.2 mol/L NaHTe溶液，95℃下搅拌回流2 h，即得到酒红色透明的CdTe量子点溶液， 4℃保存备用。

2.2.4 传感器制备 取0.1 mL 1 μmol/L捕获探针DNA （CP）与40 μL 10 mmol/L TCEP混合孵育1 h， 进行CP巯基的活化。将上述活化的CP与1 mL Fe3O4@Au溶液混合，37℃孵育12 h，CP通过AuS键自组装在磁性纳米粒子表面。然后将100 μL 1 mmol/L巯基己醇溶液加入上述溶液中，避光孵育1 h， 5000 r/min 离心10 min，弃上清液，沉淀重悬于PBS缓冲液中，即得Fe3O4@Au/capture DNA溶液。将处理好的电极浸泡在含有10 μL Fe3O4@Au/capture DNA溶液和20 μL 0.2 mol/L PBS缓冲溶液中，37℃孵育12 h。将电极浸入1 mmol/L巯基己醇（MCH）中37℃孵育1 h，以封闭电极上残留的空白结合位点。分别用PBS缓冲液和水各清洗3次。再加入不同浓度目标mRNA，37℃孵育1 h。在目标mRNA存在时，CP与mRNA两条链进行互补杂交，发卡结构被打开。用PBS缓冲液和二次蒸馏水各清洗3次。将上述电极置于20 μL酶反应缓冲液、 10 μL DNA 100 Klenow片段和2 μL 50 μmol/L dNTP的混合溶液中，37℃孵育3 h。引物（DNA1）与位于发夹暴露的颈部底端的互补序列杂交，加入聚合酶和碱基后，引物链开始扩增，将目标mRNA替换取代，mRNA可重新打开另一个发夹，形成一个循环。

3.2 修饰电极循环伏安法表征

图4是不同电极修饰过程循环伏安扫描图， a是裸电极的循环伏安图，b是自组装DNA（CP）后的Fe3O4@Au电极循环伏安曲线。 由于CP修饰在电极上，与曲线a相比，曲线b电流减弱。这是由于固定在电极表面的DNA的磷酸骨架降低了电极表面电子传递速率。加入目标mRNA后（图4曲线c），电极表面磷酸骨架增多导致电极表面的负电荷增多，相比b曲线电流明显下降。加入聚合酶、 碱基以及酶反应缓冲液后，引物从5'端向3'端延升，将目标mRNA取代，替换下的mRNA又进一步打开另一个发卡（CP），引起另一个链替代反应，因此电流明显减小（图4曲线d）。

当目标mRNA杂交后，又进一步阻碍电子传递，电极表面电子传递阻抗进一步增大（图5d）。当加入聚合酶后，形成的新链将目标mRNA替代，目标循环利用，形成的新链增长，阻抗也相应增大（图5e）。最后加入量子点标记的DNA （图5f），表面电荷进一步增加，与（图5e）相比，电子传递阻抗明显增大。

3.4 实验条件优化

4 结 论

本研究构建了基于聚合酶辅助放大的电化学发光适配体传感器，用于癌症标记物mRNA检测。通过聚合酶聚合对目标物循环放大，并结合量子点，实现了多重信号放大，提高了传感器检测灵敏度。本研究建立的放大技术为癌症标记基因的早期诊断提供了参考。

References

1 Ji H X ， Yan F， Lei J P， Ju H X.Anal. Chem.， 2012， 84（16）： 7166-7171

2 Pang H X ， Wang C W ， Wang J ， Sun Z W， Xiao R， Wang S Q.Biosens. Bioelectron.， 2016， 79： 574-580

3 Wang H S， Yang M S， Xu J， Zou B K， Zhou Q， Bian J S， Wang X W. Tumor. Biol.， 2016， 37（1）： 723-727

4 MartensUzunova E S， Bttcher R， Croce C M， Jenster G， Visakorpi T， Calin G A. Eur. Urol.， 2014， 65（6）： 1140-1151

5 Tran D A， Bai A Y， Singh P， Wu X W， Szabo P E.Nucleic Acids Res.， 2014， 42（3）： 1772-1783

6 Buxbaum A R， Wu B， Singer R H.Science， 2014， 343（6169）： 419-422

7 Yang X F， Yang J H， Wang J L， Wen Q， Wang H， He J C， Hu S F， He W T， Du X L， Liu S D， Ma L.Sci. Rep.， 2016， 6： 38963

8 Zhang N， Bing J， Liu X J， Qi C， Shen L Y， Wang L L， Shangguan D H. Chem. Sci.， 2015， 6（7）： 3831-3838

9 Yang D， Gao L， Wang T F， Qiao Z D， Liang Y J， Zhang P. Febs. Lett.， 2014， 588（23）： 4448-4456endprint

10 Liu Y Q， Zhang M， Yin B C， Ye B C.Anal. Chem.， 2012， 84（12）： 5165-5169

11 Adinolfi B， Pellegrino M， Giannetti A， Tombelli S， Trono C， Sotgiu G， Varchi G， Ballestti M， Posati T， Carpi S， Nieri P， Baldini F.Biosens. Bioelectron.， 2017， 88： 15-24

12 Wang S， Zhang L Q， Wan S， Cansiz S， Cui C， Liu Y， Cai R， Hong C Y， Teng I T， Shi M L， Wu Y， Dong Y Y， Tan W H. ACS. Nano， 2017， 11（4）： 3943-3949

13 Li J P， Sun M， Wei X P， Zhang L P， Zhang Y. Biosens. Bioelectron.， 2015， 74： 423-426

14 Bellón S， Vicent S V， Falcón R， Martín T P， Bursa J. J. Clin. Virol.， 2016， 82： S63-S64

15 Clancy E， Coughlan H， Higgins O， Boo T W， Cormican M， Barret L， Smith T J， Reddington K， Barry T. J. Microbiol. Meth.， 2016， 127： 197-202

16 Baby N， Faust A C， Smith T， Sheperd L A， Knoll L， Goodman E L. Antimicrob. Agents.Ch.， 2017， 61（4）： e02432

17 Hu R， Liu T， Zhang X B， Huan S Y， Wu C C， Fu T， Tan W H. Anal. Chem.， 2014， 86（10）： 5009-5016

18 Hu Y H， Xu X Q， Liu Q H， Wang L， Lin Z Y， Chen G N. Anal. Chem.， 2014， 86（17）： 8785-8790

19 Chen J H， Zhang J， Guo Y， Li J， Fu F F， Yang H H， Chen G N. Chem. Commun.， 2011， 47（28）： 8004-8006

20 Rand A C， Jain M， Eizenga J M， Brown A M， Olsen H E， Akeson M， Paten B. Nat. Methods， 2017， 14（4）： 411-413

21 Liu Y， Yu J. Microchim. Acta， 2016， 183（1）： 1-19

22 Samanta A， Banerjee S， Liu Y. Nanoscale， 2015， 7（6）： 2210-2220

23 Coopersmith K， Han H， Maye M M. Langmuir， 2015， 31（27）： 7463-7471

24 Lin C S， Wu Y F， Luo F， Chen D G， Chen X. Biosens. Bioelectron.， 2014， 59： 365-369

25 Peng H P， Hu Y， Liu P， Deng Y N， Wang P， Chen W， Liu A L， Chen Y Z， Lin X H. Sens. Actuators B， 2015， 207： 269-276

26 Ren W R， Gao Z Y， Li N B， Luo H Q. Biosens. Bioelectron.， 2015， 63： 153-158

27 Yang L L， Tao Y Z， Yue G Y， Li R B， Qiu B， Guo L H， Lin Z Y， Yang H H. Anal. Chem.， 2016， 88（10）： 5097-5103

28 Cai H D， Li K G， Shen M W， Wen S H， Luo Y， Peng C， Zhang G X， Shi X Y. J. Mater. Chem.， 2012， 22（30）： 15110-15120

29 Fang Q L， Zhang X Y， Xu H J， Qian H S， Xuan S H. Chem. Lett.， 2016， 45（5）： 535-537

30 Aliberti A ， Cusano A M， Battista E， Causa F， Netti P A. Analyst， 2016， 141（4）： 1250-1256

31 Xu H， Xue C， Zhang R B， Chen Y R， Li F， Shen Z F， Jia L， Wu Z S. Sens. Actuators B， 2017， 243： 1240-1247

32 Li D D， Cheng W， Yan Y R， Zhang Y， Yin Y B， Ju H X， Ding S J. Talanta， 2016， 146： 470-476

33 Zhao F L， Xie Q Y， Xu M F， Wang S Y， Zhou J Y， Liu F. Biosens. Bioelectron.， 2015， 66： 238-243endprint

Abstract A novel polymerasebased electrochemiluminescence DNA sensor was constructed for messenger RNA （mRNA） detection by cyclic chain displacement polymerization， assisted by target mRNA cycle， and quantum dots signal amplification. Firstly， the mercaptomodified capturetype capture DNA （CP） was immobilized on the surface of a magnetocontrolled glassy carbon electrode via AuS bond. After adding the target mRNA， CP was opened and hybridized with mRNA to form dsDNA. After adding polymerase， primer chain （DNA1） and the base， the primer chain was extended to replace the target mRNA. After one cycle， the mRNA chain could open another hairpin in order to carry out next cycle of amplification. Finally， electrochemical luminescence detection was carried out by adding DNA2 labeled TGACdTe quantum dots. The amplification of the target mRNA by the addition of polymerase and the signal combined with the quantum dot mark improved the sensitivity of the sensor greatly. The result showed that the logarithm of target mRNA concentration had a good linear relationship with the corresponding ECL signal in the range of 1 × 1015-1 × 10 11 mol/L， with the detection limit of 3.4 × 10 16 mol/L（S/N=3）. Under the optimal conditions， the recoveries of mRNA spiked in human serum sample were 97.2%-102.3%. This sensor exhibited good selectivity， stability and reproducibility.

Keywords DNA sensor； Polymerase； Target cycle； Signal amplification； Electrochemical luminescence

（Received 19 June 2017； accepted 10 November 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21375031， 21765006）， the Natural Science Foundation of Guangxi Province， China （No. 2015GXNSFFA139005）， and the High Level Innovation Teams of Guangxi Colleges & Universities and Outstanding Scholars Program of China （Gui Jiao Ren[2014] No. 49）endprint