水稻抗氧化酶活性测定方法的比较研究

程 艳，陈 璐，米艳华*，段红平，茶应盛，邵金良，杜丽娟

植物在正常的生长发育过程中会产生一定量的活性氧（ROS），主要有 O－2·、H2O2、·OH、·O2等［1］。在重金属胁迫下植物体内的 ROS会大量增加，导致植物内发生代谢紊乱［2］。植物通过不断地提高各种抗氧化酶的活性来消除活性氧产生的不利影响，保障植物正常的生长［3－5］。因此对植物过氧化酶活性的研究，可以掌握植物应对土壤重金属毒害的解毒应激机理，为进一步研究如何防控土壤重金属对植物的危害提供理论依据。

在抗氧化酶系统中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）是两个非常重要的检测指标。SOD的测定方法分为直接法和间接法，由于直接法所需的仪器设备价格昂贵以及SOD基质－O2－的不稳定性，一般多数采用间接法［6］。间接法分为邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、氮蓝四唑（NBT）光还原法、黄嘌呤氧化酶－NBT 法等多种方法［7－9］。 POD 的检测方法有碘量滴定法［10］、氧电极法和比色法等方法；碘量滴定法重现性差，误差大［11］；氧电极法需要特殊的仪器——氧电极仪，且需要标准酶液制作标准曲线，操作较繁杂。过氧化氢酶（CAT）的检测是根据CAT催化H2O2生成O2和H20来测定其活性，测定方法有滴定法、紫外分光光度法和氧电极法［12］。

目前在国内外的研究中，测定抗氧化酶活性的方法较多，国内外还没有统一的检测方法。由于不同检测方法的反应原理和酶活力单位定义不同，灵敏度和差异性较大，检测结果差异也较大。在SOD的测定方法中，邻苯三酚法的测定结果受pH值与邻苯三酚浓度的影响显著，因此用该方法测定SOD时必须严格控制pH，准确配制规定浓度的邻苯三酚溶液，且在进行测定时经常出现酶液对邻苯三酚自氧化速度的负抑制现象［13］；细胞色素C还原法被认为是间接法中的经典方法，但要求高纯度的细胞色素C和黄嘌呤氧化酶；而NTB还原法没有这些要求，灵敏度比前者约高14.7倍，已被广泛应用于生物学和医学研究［14－16］。 在 POD 的测定中，愈创木酚法是应用最广泛的方法，其价格较经济，且无需特殊的仪器。在CAT的测定中，滴定法误差较大；氧电极法需要专门的仪器，且CAT标准酶样品受温度的影响较大；紫外分光光度法是最常用的方法。

本文以水稻为研究对象，利用酶检测试剂盒与传统检测方法对水稻根部抗氧化酶的活性进行了检测，以便筛选出一种便捷、结果可信度高的检测方法，为后续检验测定水稻不同部位的抗氧化酶活性提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

水稻盆栽试验在云南省农业科学院科研基地进行，采用50 cm×30 cm×40 cm的塑料盆，每盆装土40.0 kg。本试验设置对照组CK（不添加Na3AsO4）和试验组 As－40（添加 40 mg／kg的 Na3AsO4）两组试验，分别在水稻旺长期取水稻根系进行抗氧化酶活性的检测。

1.2 试验材料

随机选取5株水稻，剪取根系，洗净泥沙，用蒸馏水冲洗3～5次，吸干多余水分；取待测样品0.5 g，剪碎置于玻璃匀浆器，加5 mL磷酸缓冲液（0.1 mol／L，pH 7.4），冰浴研磨制成匀浆；在低温（4℃）下离心（转速5000 r／min）10 min，取上清液即为酶粗提液；于－4℃冷藏备用。

1.3 酶试剂盒测定法

SOD活性检测采用总超氧化物歧化酶（T－SOD）测试盒（A001－1，羟胺法，南京建成科技有限公司）；CAT活性检测采用过氧化氢酶（CAT）测试盒（A007－1，可见光法，南京建成科技有限公司）；POD活性检测采用过氧化物酶（POD）测试盒（A084－3，南京建成科技有限公司）。实验过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 传统酶检测法

采用李合生的方法［17］，并加以改进。

SOD活性采用氮蓝四唑（NBT）光还原法检测：取酶液100μL，加入3.4 mL反应混合液和0.3 mL 20 μmol／L核黄素溶液，混匀，以不加酶液为对照，对照管罩黑色硬纸遮光；将测定管与对照管同时置于4000 lx灯下反应 20～30 min，于 560 nm处测定OD值。

POD活性采用愈创木酚比色法检测：取分光光度计比色杯（半径1 cm），加入反应液（含0.1 mol／L pH 6.0的磷酸缓冲液5 mL、愈创木酚28μL、30%H2O219μL）和1 mL酶液，以不加酶液为对照，混匀，立即计时，测定470 nm处的OD值，每隔1 min读数1次。

CAT活性采用紫外分光光度法检测：取酶液100 μL，加入 2.9 mL 反应液（20 mmol／L H2O2溶液），混匀。以蒸馏水为空白对照，在反应15 s后开始记录反应体系于240 nm处的OD值，即为初始值；然后每隔30 s记录1次，至少测定6个点的OD值，重复3次。

1.5 统计分析

采用SPSS 19.0统计分析软件和Microsoft Excel 2010对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 水稻根部SOD、CAT和POD活性测定分析

从图1中可以看出：用传统方法测定的水稻根部SOD的活性略高于用酶试剂盒法测定的结果，且SOD活性表现为As－40＞CK，但差异不大；用传统方法测定的CAT活性也高于用试剂盒法的检出值，但两者间无显著差异；用两种方法检测的POD活性值几乎一致。

图1 用两种方法测定的抗氧化酶活性

2.1.1 SOD检测方法的比较 采用酶试剂盒法测定样品的SOD活性并以变异系数对其精确度进行比较，表1显示酶试剂盒测定结果的变异系数均小于3%，说明酶试剂盒测定结果精确性好。在相同条件下，采用传统方法测定样品的SOD活性，其变异系数均大于酶试剂盒测定的结果，故在SOD活性检测中，酶试剂盒法优于传统方法。

2.1.2 CAT活性测定方法的比较 采用两种方法测定样品的CAT活性并以变异系数对其精确度进行比较。从表2可以看出，酶试剂盒法所测结果的变异系数均小于传统方法所测结果的，说明酶试剂盒测定结果的精确性优于传统方法的。这可能是由于传统方法的操作工序较为繁杂，每个环节都可能影响检测结果的稳定性。故在CAT活性检测中，采用酶试剂盒法检测优于传统方法检测。

表1 SOD活性测定结果的变异系数

表2 CAT活性测定结果的变异系数

2.1.3 POD活性测定方法的比较 采用两种方法测定样品的POD活性并以变异系数对其精确度进行比较。从表3可知，酶试剂盒法所测结果的变异系数均小于传统方法的。这是因为用传统方法测定时需要进行等时段的连续测定，增加了检测的难度，降低了检出值的准确度。因此，POD酶试剂盒优化了操作过程，使测定结果更稳定更准确。

表3 POD活性测定结果的变异系数

2.2 抗氧化酶活性测定方法的差异显著性比较

对两种方法测定的结果进行差异显著性比较，结果见表4。从表4可以看出，3个检测项目的P值均大于0.05，说明用2种方法测得的结果都无显著性差异。

表4 抗氧化酶活性测定结果的差异显著性

2.3 抗氧化酶活性测定结果的相关性

以传统方法测得的数据为自变量x，以试剂盒法测得的数据为因变量y，对两种方法进行相关性分析，结果见表5。表5的结果表明，用传统检测方法和酶试剂盒法检测的SOD、CAT、POD活性间的相关系数都达到了1，因此可以认为两种方法测得的3种酶活性基本相同。

2.4 抗氧化酶活性测定方法的灵敏度比较

对两种方法的进样量进行比较，结果见表6。由表6可知：在SOD活性检测中，传统检测方法的进样量是酶测定试剂盒法的1.82倍；在CAT活性测定中，酶测定试剂盒法的进样量仅为5μL，而传统检测方法的进样量为其20倍；在POD活性测定中，传统检测方法的进样量为酶试剂盒法的10倍。可见，酶试剂盒法测定的灵敏度远高于传统检测法的。

表5 抗氧化酶活性测定结果的相关性分析结果

表6 两种抗氧化酶活性测定方法的进样量比较

酶试剂盒法测得结果的变异系数小于传统检测方法的，且用两种方法测定的结果无显著性差异。综上所述，在测定水稻根系SOD、CAT、POD活性时，酶测定试剂盒法的测定结果可信度高，且操作简便。

3 讨论与结论

本研究结果表明：在砷胁迫下，水稻根部SOD、CAT活性受到抑制，这与杨桂娣等［18］的研究结果一致；而POD活性较对照升高，这与赵天宏等［19］的研究结果一致。在测定水稻根部SOD、CAT、POD活性时，酶测定试剂盒法和传统检测方法都可以采用，且两种方法的检测结果无显著差异。但从精确度方面考虑，采用酶测定试剂盒法较好。从操作方面考虑，两种方法均可采用pH 7.4的缓冲液提取3种酶，对其活性影响不大［20］。在SOD活性检测中，传统检测方法需在试剂加完并混匀后，在4000 lx灯下反应20～30 min；而酶检测试剂盒法只需在室温下放置10 min，节省了检测时间。在CAT活性检测中，传统检测方法需在反应15 s时记录其在240 nm处的OD值作为初始值，然后每隔30 s记录1次，至少获得6个点的数据，并重复3次，在结果计算中，经常由于反应时间的取值范围不准确而导致结果错误［21］；而酶检测试剂盒法则不需进行此操作。在POD活性检测中，传统检测方法需在反应液与酶液混匀后，立即开始计时，每隔1 min记录1次在470 nm处的OD值；但采用酶检测试剂盒法进行检测时只需将酶液与反应液混匀后离心（3500 r／min，10 min）即可。 可见，与传统检测方法相比，采用酶检测试剂盒法测定水稻根部 SOD、CAT、POD活性具有操作简便、快速的优点。

由于不同方法的反应原理和酶活性单位的定义不同，且从原料中得到的粗提物酶活力一般较低［22］，因此不同检测方法的灵敏度差异较大。以相同取样量采用传统检测方法测定不同样品的酶活性，会出现抑制率变化甚至难以测出其酶活性的情况。因此，从灵敏度方面考虑，酶试剂盒法测定酶活性优于传统检测方法。

［1］ Meharg A A.Ecological impact of major indus trial－chemical accidents［J］.Reviews of Environmental Contamination and Toxicology， 1994， 138： 21－48.

［2］胡拥军，王海娟，王宏镔，等.砷胁迫下不同砷富集能力植物内源生长素与抗氧化酶的关系［J］.生态学报，2015，35（10）：1－14.

［3］徐建明，李才生，毛善国.锌对水稻幼苗生长及体内SOD、POD 活性的影响［J］.安徽农业科学，2008，36（3）：877－878.

［4］龚双娇，马陶武，姜业芳，等.镉胁迫下3种藓类植物抗氧化酶活性变化的比较研究［J］.西北植物学报，2008，28（9）：1765－1771.

［5］徐勤松，施国新，王学，等.镉、铜和锌胁迫下黑藻活性氧的产生及抗氧化酶活性的变化研究［J］.水生生物学报，2006，30（1）：107－112.

［6］邵从本，罗光华，王爱国，等.几种检测超氧化物歧化酶活性反应的比较［J］.植物生理学通讯，1983（5）：46－49.

［7］徐东，赵健，黄汉昌，等.改良的黄嘌呤氧化酶法测定动植物组织中 SOD 比活力［J］.食品科学，2011，32（6）：237－241.

［8］徐滢波，赵树进，郭勇.超氧化物歧化酶检测方法评述［J］.广东药学，2002，12（1）：9－12.

［9］姜云，茅力，蔡云清.果蔬中超氧化物歧化酶的提纯与测活技术研究进展［J］.食品科学，2008，29（12）：780－785.

［10］波钦诺 X H.植物生物化学分析方法［M］.北京：科学出版社，1981：90－100.

［11］陈晓敏.测定切花中过氧化氢酶活性的3种常用方法的比较［J］.热带农业科学，2002，22（5）：13－16.

［12］王华芳，展海军.过氧化氢酶活性测定方法的研究进展［J］.科技创新导报，2009，19：7－8.

［13］曲敏，秦丽楠，刘羽佳，等.两种检测SOD酶活性方法的比较［J］.食品安全质量监测学报，2014，5（10）：3318－3323.

［14］ MeCord JM，Fridovieh I.Superoxide dismutase：an enzymic function for erythrocuprein （hemocuprein） ［J］.J Biol Chem，1969，244：6049－6055.

［15］刘智峰，方允中，施秉仪.超氧化物歧化酶活力测定及电泳图谱分析［J］.军事医学科学院院刊，1981，41：509－513.

［16］ Qin X R， Zhang M J， Qin J， et a1.Two－step purification of Cu， Zn： superoxide dismutase from pumpkin （Cucurbita moschata） pulp ［J］. Separation and Purification Technology， 2012， 87（5）： 79－83.

［17］李合生.植物生理生化实验原理和技术［M］.北京：高等教育出版社，2001：267－269.

［18］杨桂娣，郭徐魁，刘长辉，等.无机砷胁迫下苗期水稻的生理响应［J］.农产品加工学刊，2009（2）：5－6.

［19］赵天宏，裴超，赵艺欣，等.砷胁迫下超级稻根系保护酶活性和渗透调节物质的影响［J］.华北农学报，2017，27（2）：152－156.

［20］王伟玲，王战，王晶英.植物过氧化物酶活性测定方法优化［J］.实验室研究与探索，2010，29（4）：21－23.

［21］周轩，张天，任晓敏，等.SOD 提取工艺研究进展［J］.粮食与食品工业，2015，22（4）：57－62.

［22］龚屾，石英，韩毅强，等.提取缓冲液pH值对植物组织中SOD、POD和CAT酶活性的影响［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2017（2）：8－12.