桑椹缩小型菌核病菌丝裂原活化蛋白激酶基因Ｍｍｋ１的克隆与分析

朱志贤 于翠 李勇 莫荣利 邓文 胡兴明

摘要：根据核盘菌菌核形成相关丝裂原活化蛋白激酶Smk1的氨基酸序列设计出简并引物进行RT-PCR，克隆获得长度为856 bp的桑椹缩小型菌核病菌丝裂原活化蛋白激酶基因Mmk1的cDNA片段。将测序结果与GenBank数据库进行Blastx比对后，发现克隆片段所编码的氨基酸序列与其他真菌的MAPK氨基酸序列具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明，该基因的表达量随着菌株的生长而减少。Mmk1基因的分子克隆为进一步研究其在菌核形成中的作用奠定了基础。

关键词：桑椹缩小型菌核病菌;简并引物;丝裂原活化蛋白激酶

中图分类号：Q78;S888.71         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）23-0143-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.034           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

果桑是以产果为主、果叶兼用型桑树的统称，其果实桑椹具有丰富的营养和药用价值，花青素含量极高，抗氧化功效明显，具有促进造血细胞生长、降血糖、降血脂等药理作用，被卫生部列为“既是食品又是药品”名单[1，2]。桑椹除直接食用外，目前已开发出果汁饮品、桑果酒、桑果酱、桑椹膏及花青素等产品，表现出巨大的产业发展潜力和广阔的市场前景[3，4]。然而在果桑产业发展过程中，桑椹菌核病来势猛、发病快，发病率高达30%～90%，有些果桑园甚至绝产[5]，桑椹菌核病已成为限制果桑产业发展的瓶颈问题。

桑椹菌核病又称白果病，目前公认且常见的菌核病有桑椹肥大型菌核病、桑椹缩小型菌核病和桑椹小粒型菌核病3种，病原菌分别为桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana）、桑椹核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）和肉阜状杯菌（Ciboria carunculoides）[5，6]。菌核是桑椹菌核病菌越冬的重要场所，菌核随病椹落地，到次年3月上、中旬桑雌花开放时，土壤中的菌核萌发形成子囊盘。子囊盘上子实层着生子囊和子囊孢子，子囊孢子是病害初侵染的主要来源[7]。因此，了解菌核形成相关的分子机制可以为病害防治提供理论依据。Chen等[8]从核盘菌中克隆到一个高度保守的ERK-type丝裂原活化蛋白激酶编码基因（ERK-type mitogen-activated protein kinases from S. sclerotiorum，smk1），该基因在菌核形成起始阶段的表达量达到最高，smk1基因沉默菌株不能形成成熟的菌核，其表達受到酸性诱导和外源环磷酸腺苷的抑制，说明smk1基因可通过MAPK途径对环境信号作出反应并调控菌核的形成。刘蒙蒙等[9]在猪苓中同样克隆得到与smk1同源性为73%的ERK类型MAPK基因PuMAPK，实时荧光定量PCR分析结果表明猪苓菌核形成初期，菌核中的MAPK表达量随着菌核的快速生长而减少。MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内的重要传递者，其中信号调节蛋白激酶（Extracellular signal regulated protein kinases，ERKs）是MAPK家族中的3个成员之一[10]。ERKs有ERK1和ERK2两种同工酶。一般认为，ERK主要在生长因子相关刺激引起的细胞反应中起作用，主要参与细胞生长、分化和抗凋亡作用[9]。

近年来对桑椹菌核病的研究集中在病原菌鉴定，田间流行规律调查，农业、化学防治及潜在生防菌株筛选方面[7，11-13]，无菌核形成相关机理的报道。本试验根据已报道与核盘菌菌核形成相关的Smkl氨基酸保守序列设计简并引物，克隆桑椹缩小型菌核病病菌的丝裂原活化蛋白激酶编码基因（mitogen-activated protein kinases from Scleromitrula shiraiana，Mmk1），初步揭示其菌核形成分子机理，以期为开发高效专一性杀菌剂，切断菌核病的病害循环提供理论依据，为病害防控提供新的思路和线索。

1  材料与方法

1.1  供试菌株

桑椹缩小型菌核病菌Sd1-2（GenBank accession number：MH298851）分离自宜昌市三斗坪镇采集的病果;克隆菌株为大肠杆菌JM109（上海唯地生物技术有限公司）。

1.2  试剂

质粒为TaKaRa公司的pMD18TM-T vector，超纯RNA提取试剂盒、RNA纯化反转录试剂盒HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA kit、2×Es Taq Mastermix等试剂均为康为世纪公司产品，DNA回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit ver.4.0、荧光定量PCR试剂盒SYBR？誖Premix Ex TaqTM购自TaKaRa公司，SYBR Green I核酸染料为北京百泰克生物技术有限公司产品，琼脂糖、蛋白胨、酵母膏等常规试剂购自上海生工公司。氨苄青霉素（Amp）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自北京酷来博科技有限公司，20 mg/mL X-gal购自赛国生物科技，引物合成和测序在擎科生物科技有限公司进行。

1.3  简并引物的设计和筛选

将核盘菌菌核形成相关的丝裂原活化蛋白激酶Smk1氨基酸序列在NCBI中进行Blastp比对，选取与其同源的代表性氨基酸序列采用ClustalX（version 1.83）对序列片段进行比对（alignment）[14]，设定参数如下：多重序列比对参数：起始空位罚分（gap opening）=10，延伸空位罚分（extension opening）=0.2，转移权系数（transition weight）=0.5，延迟发散序列（delay divergent sequences）=30%，根据需要对比对结果进行校对[8]。登录Blockmaker，对上述序列进行Block比对，从Block results界面登录CodeHop数据库，进行简并引物设计[15]，利用Oligo 7.37对筛选的引物分析做进一步筛选。

1.4  RT-PCR扩增Mmk1基因片段

将Sd1-2菌株转入铺有灭菌玻璃纸的PDA平板中央培养，25 ℃条件下培养20 d后收集菌丝。采用超纯RNA提取试剂盒按说明书步骤提取其总RNA，用微量紫外分光光度计检测合格后，用RNA 纯化反转录试剂盒HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA kit去基因组DNA和反转录。以反转录产物为模板，用设计的简并引物DMMK1-F/ DMMK1-R扩增Mmk1的cDNA片段，反应在50 μL PCR体系中进行，包括2×Es Taq Mastermix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板cDNA 10 ng 1 μL，加入ddH2O至体系体积达50 μL。PCR扩增参数为：95 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min。

1.5  RT-PCR产物的检测、克隆与测序

PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳和紫外观察，切取目的条带，用TaKaRa回收试剂盒回收，回收产物与pMD18TM-T vector进行连接后转化JM109大肠杆菌，然后在含有AMP、IPTG和X-gal的抗性LB固体培养基平板上37 ℃培养过夜，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证，然后将阳性克隆送样至擎科生物公司，采用载体通用引物M13-47/RV-M双向测序分析。

1.6  Mmk1基因片段测序结果分析

测序后的片段在NCBI中进行Blastx比对，选取与其同源的代表性氨基酸序列用ClustalX（version 1.83）进行多序列比对，用MEGA 5.05软件中的最大似然法构建系统进化树，选用Jone-Taylor-Thomton（JTT）模型，进化树用自展分析法进行检验，循环1 000次。

1.7  Mmk1基因表达分析

为了分析Mmk1基因在不同时间点的表达情况，提取了在PDA平板上培养7、14和21 d的菌株Sd1-2菌丝RNA。反转录成cDNA后，根据克隆的Mmk1基因序列设计引物MMK1-F/MMK1-R：5′-ATCGTTCACCGAAGTCTACCTG-3′/5′-CTCTGTGT

AGGACGTTGGCAG-3′进行实时荧光定量PCR扩增。PCR反应设定为10 μL总反应体系，其中包括5 μL 2×SYBR？誖Premix ExTaqTM Master Mix，0.5 μL引物（2.5 μmol/L），0.2 μL ROX Reference Dye，1 μL cDNA模板和2.8 μL ddH2O。反应循环参数设定如下：95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，40个循环。反应结束后采用2-ΔΔCt法进行计算不同处理组的相对表达量，以β-tubulin基因（5′-TTGGA

TTTGCTCCTTTGACCAG-3′/5′-AGCGGCCATCATGT

TCTTAGG-3′）作为内参基因，每个反转录样品重复3次试验。采用DPS（version 3.01）软件对数据进行方差分析，并用LSD法比较不同处理间的差异显著性（P<0.05）。

2  结果与分析

2.1  简并引物的设计和筛选

将核盘菌菌核形成相关的丝裂原活化蛋白激酶Smk1氨基酸序列在NCBI中进行Blastp比对，选取与其同源的代表性菌株的MAPK氨基酸序列用ClustalX进行多序列比对（图1），根据需要对比对结果进行校对，登录Blockmaker进行Block比对，得到9个高度保守的连续氨基酸区域（Blocks），从Block results界面登录CodeHop数据库，进行简并引物搜索，根据上、下游引物之间的Tm值和简并度不能相差太大，简并度控制在32以下;同时保证引物克隆足够长的片段的原则。筛选出保守结构域PFDHSMFCL和FFDFDKNKDNLT设计的上、下游引物DMMK1-F/DMMK1-R：5′-CCCATTCGATCAC

TCCatgttytgyyt-3′/5′-CAGGTTATCCTTGTGCTTATC Gaartyraaraa-3′，用Oligo 7.37对其分析未发现引物二聚体和发夹结构。

2.2  RT-PCR扩增及扩增产物的克隆、测序

提取菌株Sd1-2的RNA（图2），反转录合成cDNA后，用DMMK1-F/DMMK1-R为引物进行PCR扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图3，片段大小与预测结果大小基本一致。由琼脂糖电泳检测结果可见，这种引物的特异性较好，基本没有非特异条带。切胶后，用DNA回收试剂盒回收目标片段，连接载体转化后，用通用引物M13-47/RV-M对转化子进行菌落PCR扩增验证（图4），将阳性克隆送样测序。

2.3  Mmk1基因片段测序结果分析

利用设计的简并引物进行RT-PCR，克隆到长度为856 bp cDNA片段（图5）。测序后的片段在NCBI中进行Blastx比对，发现其与Sclerotinia sclerotiorum的MAPK氨基酸的同源性为99%，并都与已发表的其他真菌MAPK氨基酸高度同源。选取与其同源的代表性氨基酸序列用ClustalX（version 1.83）进行多序列比对，用MEGA 5.05软件构建的系统发育树结果表明Mmk1序列与Sclerotinia sclerotiorum和Botrytis cinerea的MAPK氨基酸序列聚为一类（图6）。

2.4  Mmk1基因表達的实时荧光定量PCR检测

利用实时荧光定量PCR检测了在PDA平板上培养7、14和21 d Sd1-2菌株（图7A）Mmk1基因的表达量，发现Mmk1基因的相对表达量随着菌株培养时间的延长而减少，但差异不显著（图7B）。

3  小结与讨论

本研究利用CodeHop设计的简并引物DMMK1-F/DMMK1-R，经RT-PCR扩增出特异片段，克隆获得856 bp桑椹核地杖菌丝裂原活化蛋白激酶基因Mmk1的cDNA片段，Blastx比对发现Mmk1与核盘菌菌丝裂原活化蛋白激酶Smk1同源性为99%，系统进化树分析发现MMK1序列与Sclerotinia sclerotiorum和Botrytis cinerea的MAPK氨基酸序列聚为一类。实时荧光定量PCR结果表明该基因的表达随着菌株的生长而减少。

由于S. shiraiana基因组序列未知，试图用其他已经发表的核盘菌Smk1引物[8，16]来扩增S. shiraiana中的Mmk1基因，但均未成功。经过Blastn比对发现不同物种间MAPK基因核苷酸序列差异较大，而氨基酸序列相对保守。由于密码子偏好性差异，不同的核酸序列可能表达出相同的氨基酸序列，而氨基酸序列才具有真正的保守性，因此采用氨基酸序列设计简并引物。在CodeHop引物的简并设计过程中，引物搜索后得到的结果中往往会出现大量的引物序列，这时合适的筛选方法和筛选工具尤为重要[17]。本试验首先根据目标引物位置、片段长度、引物Tm值和简并度对上、下游引物进行初次筛选，接着利用生物软件Oligo7.37对初次筛选结果进行分析，这样就能够得到较优化的引物对，使得试验成功更有保证。

将克隆的Mmk1基因编码的氨基酸序列与其他真菌MAPK氨基酸序列进行聚类分析，发现Mmk1序列虽然与核盘菌、灰霉菌的MAPK氨基酸序列聚为一类，但是在不同分支上，核盘菌和灰霉菌却在同一分支上。该结果与它们的分类地位一致，桑椹核地杖菌属于地舌菌科核地杖菌属，而灰霉属于核盘菌科葡萄孢盘菌属[18]，说明桑椹核地杖菌与核盘菌亲缘关系较远。该现象与苏正川[11]报道类似，但王爱印[19]发现桑椹核地杖菌菌株SXSG-5在PDA培养基上培养9周，可在培养基内部产生黑色块状菌核，在查氏培养基上培养12周，亦可在其内部产生黑色颗粒状菌核。鉴于本试验未在PDA上发现菌株Sd1-2产生菌核，菌株在PDA平板上7 d左右才能看到有明显的菌丝形成，14 d左右菌丝随着菌株生长逐渐凝结形成凸起，21 d左右菌落上产生乳白色液体，镜检发现为该菌的分生孢子堆。这3个时间点菌株形态有较大变化，因此选择这3个时间点检测Mmk1基因的表达情况。核盘菌smk1和猪苓PuMAPK基因均是在菌核形成初期表达量最高，随着菌核的生长而减少[8，9];Mmk1基因表达也是在菌丝凝结后逐渐减少，与核盘菌smk1和猪苓PuMAPK基因表达类似。本研究成功克隆了Mmk1基因部分cDNA片段，为下一步利用RACE等技术克隆该基因全长，通过RNAi等手段进一步研究该基因在桑椹缩小型菌核病菌菌核生长发育中的生物学功能提供了理论依据。

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