MET70对有机磷农药的广谱降解特性及降解乐果机理研究

张钲 佘梦林 袁淑博 陈晓通 刘诚 倪红

摘要：为找寻处理磷化工污水的高效菌株，以筛选鉴定出的嗜麦芽寡养单胞菌MET70为材料，测定了其降解5种有机磷农药的最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC），以及pH值、温度对降解效果的影响，并采用HPLC初步分析了MET70对乐果的降解机理。结果表明：MET70对氧乐果、乐果、敌敌畏、甲基对硫磷和毒死蜱5种农药有广谱降解效果，降解5种农药的最适pH分别为8.0、8.0、9.0、7.0和9.0，对应的降解率分别为64.8%、46.36%、50.22%、31.36%和84.01%;最适温度分别为30℃、35℃、30℃、30℃和35℃，对应的降解率分别为64.21%、47.83%、45.8%、32.98%和77.7%。MBC从大到小依次为：乐果（1024）>氧乐果（1024）≈敌敌畏≈甲基对硫磷>毒死蜱（256），对乐果的耐受能力最强。在摇瓶实验中，MET70在120h里，对50mg/L乐果的降解率达89.66%。其中，MET70对乐果和氧乐果的降解稳定性最好。用HPLC检测分析MET70降解乐果过程中，没有新的物质出现，从而初步判断MET70对乐果的降解是完全矿化作用。对有机磷农药而言，MET70是一株具有广谱耐受力和降解能力的菌株。

关键词：嗜麦芽寡养单胞菌;有机磷农药;广谱降解;机理

中图分类号：0657

文献标识码：A

文章编号;1674-9944（2018）10-0041-05

1引言

我国是一个农业大国，为保证农作物增产保丰，不可避免地施用大量的化肥和农药。有机磷农药作为一种广谱、高效的杀虫剂，使用量占农药总量的40%左右，有机磷农药具有高毒性、难降解的特点，会对环境造成严重危害。一般情况下，化学磷肥和有机磷农药的当季利用率仅有10%～20%，土壤中未利用的化肥和残留农药随着灌水和降雨等淋溶作用不断汇入地表水、地下水，不仅造成磷资源浪费，还直接导致了地表水富营养化。目前对于作物生长过程中的化肥农药减施增效技术已成为当前研究热点。其中微生物除磷技术的研究最为广泛。嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）是一种广泛存在于土壤、水体和植物根系的革兰氏阴性杆菌，其代谢功能多样化。田江等人筛选出一株嗜麦芽寡养单胞菌TPSB1具有溶磷和重金属抗性作用;Dubey KK等人口从狼尾草根部得到一株嗜麦芽寡养单胞菌MHF ENV20，能表达有机磷水解酶（mpd），对受毒死蜱污染的土壤有很好的的生物修复作用;Shen Y J等人发现一株对有机磷农药有广谱降解作用的菌株SMSP-l对甲基对硫磷（PNP）、杀螟硫磷、乙基对硫磷、倍硫磷、辛硫磷等都有一定的降解能力等。

从磷化工污水处理厂的活性污泥中，篩选鉴定出一株具有高效聚磷作用的嗜麦芽寡养单胞菌MET70，以该菌株为材料，研究了该菌株对氧乐果、乐果、敌敌畏、甲基对硫磷和毒死蜱等5种不同有机磷农药的最小杀菌浓度（MBC），以及pH值、温度对降解效果的影响，并采用HPLC法对乐果的降解机理进行了初步分析，以期为该多功能菌株在磷化工污水处理中更好地应用，提供实验依据。

2材料和方法

2.1菌株、试剂和仪器

从某污水处理厂活性污泥中，筛选得到的具有高效聚磷作用的嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） MET70作为实验菌株，来探讨它的降解有机磷农药特性。

毒死蜱标品、敌敌畏标品、乐果标品、氧乐果标品、甲基对硫磷：均购于Achemtek Co.，Ltd.（USA），色谱级乙腈（纯度为：99.8%）购于MREDA，其他常规试剂均为分析纯，购于国药化学集团化学试剂有限公司。

高效液相色谱仪（HPLC）：型号，岛津LC20-AT。

2.2培养基

LB培养基：蛋白胨10g、酵母浸膏5g和Naci5g，蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0～7.2。用于菌株的活化和保藏。

MSM基础培养基（Murashig and Skoog Medium）：K2HP041.5g、KH2P040.5g、MgS04·7H200.2g、NaCl1.0g和（NH4）2SO41.0g，蒸馏水定容至1000mL，农药待培养基冷却至50℃左右时加入。用于农药的降解试验。

以上均121℃高压灭菌20min后使用。所有固体培养基是在液体培养基的基础上添加2%的琼脂粉。

农药标准液的配制：①毒死蜱标准液（5g/L）。用色谱级乙腈溶解，依次稀释成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L系列浓度。②敌敌畏1000mg/L标准液。用色谱级甲醇，依次稀释成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L的系列浓度。③乐果标准液（5g/L）。用色谱级乙腈溶解，依次稀释成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L系列浓度。④氧乐果标准液（5g/L）。用色谱级乙腈溶解，依次稀释成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L系列浓度。⑤甲基对硫磷1000mg/L标准液。用色谱级甲醇，依次稀释成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L的系列浓度。

以上农药标准液使用前均使用0.22nm微孔过滤除菌。

2.3实验方法

2.3.1MET70对5种有机磷农药的广谱降解实验

（1）MET70对5种有机磷农药的最小杀菌浓度（MBC）实验。

①用灭菌蒸馏水分别将5种有机磷农药（氧乐果、敌敌畏、甲基对硫磷、毒死蜱和乐果）按梯度稀释配成终浓度1、4、16、64、256和1024mg/L的溶液，并将9.9mL农药稀释液分装入10mLEp试管内。

②复苏MET70.收集菌体并用无菌水调至菌液浓度OD600nm=1.0。

③分别将100цL菌液加入配制好的不同浓度的Ep管中。同时设阳性对照（不加农药处理）和阴性对照（不加菌液处理），每组设3次重复。

④将农药与菌体的混合液在28℃，150r/min下培养24h。

⑤将LB平板均匀划分为8个区域，用接种环按梯度蘸取各实验管内的混合液，在划分区域以Z字型划线。

⑥将平板倒置28℃，培养36～48h，每隔12h观察菌落生长状况，并拍照记录。

⑦评估细菌细胞在平板各区域的生长情况，其中开始无细菌生长的浓度即为最小杀菌浓度（MBC）。

（2）农药标准曲线的绘制。将上述农药标准品配制成不同浓度的溶液，经o.22μm孔径滤膜过滤后，采用高效液相色谱法（HPLC）测定。

洗脱过程使用hypeisd ODS2（C18 reverse-phase）column（4.6mm*250mm;dp：5μm）反相色谱柱，进样体积20μL。5种农药的洗脱条件见表1。以农药对应的特征峰面积为纵坐标，标样的浓度（mg/L）为横坐标绘制标准曲线，各农药的浓度标准曲线及洗脱特性见表2。

（3）pH对MET70菌株降解5种有机磷农药的效果影响。研究不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0）对MET70降解5种农药效果的影响。将MET70菌悬液（OD600nm=1.0）按2%的接种量分别加入含有不同农药的MSM基础培养基（农药终浓度50mg/L）中，在28℃，150r/min培养5d后取样，进HPLC检测，将HPLC外标峰面积带入各农药的标准曲线得到相应的农药浓度，在不同pH条件下，MET70对农药的降解效率公式如下：

降解率（%）=（1-A/A。）×100%

式中，Ao为农药的初始浓度;A为农药的残留浓度

上述实验都以等量无菌水代替MET70菌液作为对照。设置3个重复并取平均值进行作图。

（4）温度对MET70菌株降解五种有机磷农药的效果影响。研究不同温度（20、25、30、35、40和45℃）对MET70降解5种农药效果的影响。将MET70菌悬液（OD600nm=1.0）按2%的接种量分别加入含有不同农药的MSM基础培养基（农药终浓度50mg/L）中，在最适pH值条件下，150r/min培养5d后取样，HPLC法测定农药的残留浓度，并计算不同温度下MET70对农药的聚磷率，计算方法同上。上述实验都以等量无菌水代替菌液作为对照。每组实验重复三次。

2.3.2MET70菌株降解乐果机理研究

（1）MET70菌株的生长曲线和降解乐果曲线。将OD600nm=1.0的MET70菌悬液，按照2%的接種量加入乐果终浓度为50mg/L的无机盐培养基中（pH一9.0），在28℃，150r/min条件下，每隔一段时间（0、6、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96和120h）取样。将样品于12000r/min离心5min，菌体用PBS重悬后，测定OD600nm，绘制出菌的生长曲线;同时利用高效液相色谱分析上清液中乐果含量的变化，并计算降解率，计算方法同上。所有实验均重复3次取平均值。绘制MET70降解乐果的降解曲线，分析MET70否能利用乐果做唯一碳源进行生长。

（2）MET70菌株降解乐果机理分析。用高效液相色谱对上述MET70降解乐果过程中，按照0、12、24、36、72和120h时间间隔取样分析，并对峰形进行叠加处理，分析降解乐果过程中是否有新物质的产生。

3结果与分析

3.1MET70菌株对5种有机磷农药的广谱降解实验

3.1.1MET70菌株对5种有机磷农药的最小杀菌浓度（MBC）实验

MET70菌体与6个浓度梯度（1、4、16、64、256和1024mg/L）的5种农药共培养24h后，5种农药的耐受范围和最小杀菌浓度（MBC）见图1。

由图1可知，氧乐果（A）、敌敌畏（B）和甲基对硫磷（C）对MET70的最小杀菌浓度（MBC）均为1024mg/L：菌株对3种农药的耐受范围高于256mg/L，低于1024mg/L。毒死蜱对MET70的毒性作用较大，MBC为256mg/L：对毒死蜱的耐受浓度高于64mg/L，低于256mg/L。

乐果对MET70的MBC超过1024mg/L：当乐果浓度达到1024mg/L时，仍有部分菌体能够维持活性，说明MET70对乐果的耐受能力最强。

实验表明，MET70对5种有机磷农药都有一定的耐受作用，耐受能力从大到小依次为：乐果>氧乐果≈敌敌畏≈甲基对硫磷>毒死蜱;初步推测MET70对5种农药的降解能力与耐受能力呈正相关，即对农药的耐受能力越强，降解潜力越大。

3.1.2pH值对MET70菌株降解5种有机磷农药的效果影响

不同pH值条件下，MET70菌株对5种有机磷农药的降解率，如图2所示。由图2可知，降解5种农药的最适pH由上到下，依次为8.0、8.0、9.0、7.0和9.0，对应的降解率分别为64.8%、46.36%，50.22%、31.36%和84.01%。其中，对乐果的降解效果最明显，氧乐果次之，且MET70在pH值7.0～10.0的范围内对两种农药的降解稳定性较好，均能维持在55%以上;对甲基对硫磷和敌敌畏的降解受pH值影响较大，稳定性不高;对毒死蜱的降解效果虽然最弱，但降解效果受pH值影响不大，稳定性较好。

可见，MET70对5种有机磷农药有广谱降解效果，且降解特性总体与耐受性规律基本一致，最适pH值范围在7.0～9.0之间，更适宜在碱性条件下发挥降解作用。

3.1.3温度对MET70菌株降解5种有机磷农药的效果影响

不同温度条件下，MET70对5种农药的降解效率，结果见图3。由图3可知，MET70对降解5种农药的最适范围在30～35℃之间，最适温度由上到下，依次为30℃、35℃、30℃、30℃和35℃，对应的降解率分别为64.21%、47.83%、45.8%、32.98%和77.7%。其中，MET70对乐果和氧乐果的降解稳定性最好，对毒死蜱，敌敌畏和甲基对硫磷的降解效果受温度影响较大。温度降解特性与pH值降解特性相似，对乐果和氧乐果的降解行能和稳定性尤为突出。

3.2MET70菌株降解乐果机理研究

3.2.1MET70菌株的生长曲线和降解乐果曲线

MET70在MSM液体培养基（乐果含量为50mg/L）中，28℃、150rpm下培养120h，在不同时间点（0、6、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96和120h）下的MET70生长量及相应的乐果降解率如图4所示。

由图4可知，MET70对乐果的降解效率随培养时间的变化而改变：在0～6h时，MET70菌体生长速度缓慢，对乐果的降解几乎停滞;在6～12h时，MET70进入对数生长期，此时菌浓度迅速增至1.299，乐果浓度由50.12mg/L下降到36.27mg/L，对乐果的降解效率逐渐增大至27.46%;在12～36h时，MET70生长进入稳定期，降解速率较对数期变缓，菌浓度逐渐稳定在OD800nm=1.831，对乐果的降解率为63.62%;在随后的84h内，MET70的生长量处于动态平衡，降解效率为85.3%;在120h乐果浓度降到最低5.17mg/L，此时乐果的降解效率约89.66%。

结果表明，MET70能够利用乐果作唯一碳源进行生长代谢，但生长周期较正常营养条件下的有所延长。在0～36h时，MET70的细胞密度由0.02增加到1.831（OD600nm），且MET70的降解趋势与细菌的生长曲线几乎一致，说明在此期间，MET70降解乐果供自身生长代谢所需;而36～120h，菌体处于稳定期向衰亡期过度时期，此时乐果浓度的继续缓慢下降，可能是与有机磷水解酶的活性下降有关。

3.2.2MET70菌株降解乐果机理分析

在MET70菌株在降解乐果的摇瓶实验中，每隔一定时间（0、12、24、36、72和120h）进行取样，用高效液相色谱检测，并將峰形图进行叠加处理，结果见图5。

由图5可知，随着取样时间的延长，乐果的特征峰（出峰时间约5.583min）面积不断减小，0～36h内，MET70对乐果降解速率较快，峰面积减小了约3/4;36～72h内，对乐果降解速度逐步变缓;72～120h内，乐果降解几乎停滞。该结果与图4的结果相吻合，在菌体增殖过程中对乐果的降解速率较快，进入稳定一衰亡期后，菌体对乐果仍有一定的降解能力。图5还显示MET70降解过程中无新的中间产物出现，初步预测MET70对乐果的降解为完全矿化作用。

4讨论

本实验室从湖北某污水处理厂的活性污泥中，筛选出一株具有高效的聚磷作用的嗜麦芽寡养单胞菌（命名为MET70），其对氧乐果、敌敌畏、甲基对硫磷、毒死蜱、乐果等有机磷农药具有广谱耐受力和降解能力，在pH值（7.0～9.0）和温度（30～35℃）范围内，表现出广泛的适应性和稳定性。

研究MET70降解乐果的特性时，虽然降解过程无新的物质峰出现，但无直接证据表面MET70对乐果降解为矿化作用，可能是中间产物直接参与了菌体的生长代谢，或是出现了不稳定中间产物未被检出。因此，有必要缩短间隔取样时间对降解乐果的途径作进一步研究，再利用GC-MS检测物质结构，结合基因数据分析可能的降解过程。