人肿瘤抑制因子folliculin的N端结构原核表达纯化

皮业勤，吴哲俊，申一凡，陈婷，陆昌瑞，张云龙

（东华大学 生物科学与技术研究所，上海 201620）

Birt-Hogg-Dube´（BHD）综合征是一种常染色体显性遗传性疾病，1970年由Birt、Hogg和Dube三位加拿大医生发现，临床表现主要包括良性毛囊瘤、肾囊肿和肾肿瘤等[1-3]。直至2001年，对大量BHD综合征患者遗传连锁分析才发现其致病与BHD基因（又称FLCN基因）缺失或突变相关[4]。Nickerson，M.L.等探查了BHD综合征患者的嫌色细胞肾癌与FLCN二次突变相关，暗示了FLCN是一个肿瘤抑制基因[5]；随后对裸鼠皮下注射FLCN缺陷细胞株长出肿瘤和注射转染野生型FLCN后显著降低肿瘤发生率对比，证明了FLCN的肿瘤抑制功能[6-7]。这些研究确定了FLCN是一种肿瘤抑制因子，但其与BHD综合征的致病关联尚未明确。

FLCN基因位于常染色体17p11.2，编码579个氨基酸的64kDa蛋白[8]。BLAST氨基酸序列比对发现，FLCN与现已知蛋白都没有显著同源性[9]，但其在单细胞生物（酵母）到哺乳动物（咧齿类动物、犬类和人类）具有高度保守性[10]，表明FLCN是一种关键的细胞调控因子。目前，FLCN的结构与功能研究仍处于模糊阶段。2012年，Nookala R.K.等利用X射线衍射技术解析了FLCN C端341-566氨基酸区段（FLCN-CT）三维结构，经结构比对发现其与DENN1B的DENN结构域相似，推测FLCN-CT具有鸟苷酸交换因子（GEF）功能[11]，但这并不能解释FLCN突变或缺失导致BHD综合征的致病机理。笔者对FLCN二级结构预测发现，其1-360aa.区段多为无序结构，无序区域由于构象多变而发挥重要的生物学功能[12]。FLCN基因进化分析发现它是一个进化上非常保守的基因，特别是100-230aa.这段序列[11]，说明FLCN的N端具有很重要的功能。

笔者使用的载体ppSUMO是pET28a改造而来的，表达的SUMO蛋白有助融合蛋白的高表达和溶解性[13]。在成功构建ppSUMO-N362重组质粒后，经表达纯化N362融合蛋白后切去标签，可获得纯度80%的N362蛋白。生物信息学分析发现N端多无序区域且保守区域100-230aa.有强疏水性，极易形成疏水性片段，推测其可能作为FLCN形成聚合体或转运结合的区域。总之，这些研究将为进一步FLCN结构与功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒ppSUMO、pET28a-FLCN由本实验室保存，E.coli DH5α、E.coli BL21购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Phusion DNA聚合酶和ULP1酶、质粒小量提取试剂盒购自Thermo Scientific公司，限制性内切酶 BamHI、XhoI和T4连接酶购自NEB公司；HRP-labeled 6×His 单抗购自Proteintech公司；Ni-NTA Agarose和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自QIAGEN公司，HiTrap Q FF 1mL强阴离子预装柱购自美国GE公司，超滤管购自MERCK公司，其他无机盐试剂均为国产分析纯。高压细胞破碎仪JNBIOJN-3000，蛋白纯化层析仪SCG p100。

1.2 FLCN的二级结构预测

在psipred网站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）上输入人源FLCN的氨基酸序列可得到FLCN二级结构无序性的预测，它是基于DISOPRED3版本的预测结果。在expasy网站(https://web.expasy.org/protscale/)上输入人源FLCN的氨基酸序列可得到其氨基酸亲疏水性的预测结果。

1.3 ppSUMO-N362重组质粒的构建

以pET28a-FLCN为PCR模板设计引物，N362 F：5'- ATACAT GGATCC AAT GCC ATT GTT GCC CTG TGTC -3'，N362 R：5'- ATACAT CTCGAG TTA ACG AAA ACT CGG TGC GC -3'（划线部分为酶切位点）。用常规PCR程序进行扩增。对载体和PCR产物进行5'BamH I和3'XhoI双酶切，切胶回收后用T4连接酶16℃连接过夜；连接产物转化至E.coil DH5α感受态细胞，摇菌抽提质粒电泳检测，条带正确的送生工测序鉴定。

1.4 N362融合蛋白表达并亲和纯化

将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21感受态细胞中，涂布平板后挑取单克隆过夜培养。次日将菌液加到1L的TB培养基中37℃ 225r/min培养至OD6000.6左右，加入终浓度0.1mmol/LIPTG诱导剂16℃过夜表达。

对表达好的菌液进行3500r/min 4℃离心30 min，弃上清后在冰上加入20mL bind buffer（25mmol/LNa2HPO4pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑）重悬菌沉，加入终浓度1mmol/LDMSF蛋白酶抑制剂，用高压细胞破碎机在4～6℃下1×105～1.5×105kPa破碎细胞两三次后，12 000 r/min 4℃离心1h。将上清加入预先用Bind Buffer（25 mmol/LNa2HPO4pH8.0，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）处理的Ni-NTA亲和层析柱中，重复结合两次后，加入大量的Wash buffer（25 mmol/LNa2HPO4pH8.0，500 mmol/LNaCl，20 mmol/L咪唑)洗涤，杂蛋白洗去后用Elute buffer（25 mmol/L Na2HPO4pH 8.0，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白；将洗脱液用30 kD超滤管浓缩保存。各组分用12%SDS-PAGE和Western blot进行检测。

1.5 N362融合蛋白离子交换纯化

N362融合蛋白的预测等电点是5.7，选用GE的HiTrap Q FF 1mL强阴离子预装柱，用SCGp100蛋白纯化层析系统来进行纯化。先用5CV BufferB（20 mmol/L磷酸盐缓冲液pH8.0，500 mmol/L NaCl）清洗柱子后，再用10CV Buffer A（20 mmol/L磷酸盐缓冲液pH8.0）平衡柱子，设置程序：用Buffer A和 Buffer B设置从0到500 mmol/L NaCl盐浓度梯度，共收集45mL，设置流速1mL/min，警报压力0.3 MPa，每管收集1mL。进样后开始程序，收集洗脱峰流出的样，用12% SDS-PAGE跑胶鉴定后将纯度高的目的蛋白用30kD超滤浓缩管浓缩保存。

1.6 用ULP1酶对融合蛋白酶切

将纯化好的融合蛋白和1 μLULP1酶加入到bufferA（50 mmol/LTris-HCl，pH 8.0，1 mmol/LDTT）定容至5mL，4℃条件下静止酶切过夜。将酶切好的蛋白溶液转移到平衡好的Ni-NTA亲和层析柱中，二次过柱收集穿出液。将穿出液用10kD超滤浓缩管浓缩保存。

2 结果与讨论

2.1 FLCN二级结构预测显示N端多无序区域

在psipred网站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）上预测得到人源FLCN二级结构的无序区域如图1a所示，其中横坐标表示FLCN一级结构氨基酸的排列顺序，纵坐标表示蛋白无序性的可信度打分，可信度高于0.5即当蓝线高于灰色虚线时，对应的氨基酸被认为是无序的；橙色线显示无序蛋白质结合残基预测的可信度。从图中可以看到，FLCN的无序区段主要是在1-360 aa.即研究的N端，并且打分很高即可信度很高，具有很高的研究价值。

在expasy网站(https://web.expasy.org/protscale/)上预测人源FLCN的氨基酸亲疏水性的结果如图1b所示，其中横坐标表示FLCN一级结构氨基酸的排列顺序，纵坐标表示蛋白亲疏水性的可信度打分，正值表示疏水，负值表示亲水；可以看到FLCN的N端保守性区域100-230 aa.主要是正值且打分很好，说明有强疏水性即极易形成疏水性片段，推测可能作为FLCN形成聚合体或转运结合的区域。

图1 FLCN二级结构预测

2.2 ppSUMO-N362重组质粒构建

将扩增后的N362片段插入ppSUMO载体构建重组质粒ppSUMO-N362，将构建好的质粒与ppSUMO载体进行电泳，检查的结果如图2所示，测序结果显示构建成功且无突变。

图2 ppSUMO-N362的克隆鉴定

2.3 (His)6-SUMO-N362融合蛋白镍柱亲和纯化

对表达菌进行诱导培养可以获得大量融合蛋白，经高压破碎细胞后融合蛋白大部分可融，经镍柱纯化时用大量的Wash Buffer漂洗后能将大部分杂蛋白洗去，洗脱的目的蛋白纯度可高达70%；Western Blot检查显示重组蛋白成功表达并且很少降解（图3上侧）。

图3 (His)6-SUMO-N362融合蛋白表达纯化

2.4 (His)6-SUMO-N362融合蛋白离子交换后酶切

经镍亲和纯化后的融合蛋白纯度不是很高，所以尝试用HiTrap Q FF 1mL强阴离子预装柱来纯化融合蛋白，如图4所示，当升高洗脱液的盐浓度至300mmol/L NaCl时开始出峰，收集出峰处的洗脱液进行浓缩保存。用ULP1酶对浓缩蛋白低温过夜酶切，可以将绝大部分的重组蛋白切开，二次过柱后穿出的浓缩样纯度可达到80%（如图4）。

图4 (His)6-SUMO-N362融合蛋白的分子筛纯化

3 结论

本实验利用pET28a改造而来的ppSUMO载体来构建ppSUMO-N362重组质粒，融合蛋白的表达量和可溶性都很高，经镍柱一步纯化后获得纯度高达70%，使用强阴离子Q柱进行纯化的效果没有很好，接下来用ULP1酶切，可以将绝大部分的重组蛋白切开，二次过柱后穿出的浓缩样纯度达到80%，目前对于FLCN及其N端蛋白的结构还没有具体研究报道，纯化的FLCN N端片段为后期结构研究提供基础。

[1]Scalvenzi M,Argenziano G,Sammarco E,et al.Hereditary Multiple Fibrofolliculomas,Trichodiscomas and Acrochordons: Syndrome of Birt-Hogg-Dube [J].Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology : JEADV,1998,11(1):45-47.

[2]Birt A R,Hogg G R,Dube W J.Hereditary Multiple Fibrofolliculomas with Trichodiscomas and Acrochordons[J].Archives of dermatolo gy,1977,113(12):1674-1677.

[3]Toro J R,Glenn G,Duray P,et al.Birt-Hogg-Dube Syndrome:a Novel Marker of Kidney Neoplasia [J].Archives of dermatolo gy,1999,135(10):1195-1202.

[4]Khoo S K,Bradley M,Wong F K,et al.Birt-Hogg-Dube Syndrome:Mapping of a Novel Hereditary Neoplasia Gene to Chromosome 17p12-q11.2 [J].Oncogene,2001,20(37):5239-5242.

[5]Nickerson M L,Warren M B,Toro J R,et al.Mutations in a novel gene lead to kidney tumors,lung wall defects,and benign tumors of the hair follicle in patients with the Birt-Hogg-Dube syndrome[J].Cancer Cell,2002,2(2):157-164.

[6]Yang Y,Padilla-Nash H M,Vira M A,et al.The UOK 257 Cell Line: a Novel Model for Studies of the Human Birt-Hogg-Dube Gene Pathway[J].Cancer Genet Cytogen,2008,180(2):100-109.

[7]Hudon V,Sabourin S,Dydensborg A B,et al.Renal Tumour Suppressor Function of the Birt-Hogg-Dube Syndrome Gene Product folliculin[J].J Med Genet,2010,47(3):182-189.

[8]Schmidt L S,Nickerson M L,Warren M B,et al.Germline BHDMutation Spectrum and Phenotype Analysis of a Large Cohort of Families with Birt-Hogg-Dube syndrome[J].American Journal of Human Genetics,2005,76(6):1023-1033.

[9]Vocke C D,Yang Y,Pavlovich C P,et al.High Frequency of Somatic Frameshift BHD Gene Mutations in Birt-Hogg-Dubeassociated Renal Tumors[J].Journal of the National Cancer Institute,2005,97(12):931-935.

[10]Singh S R,Zhen W,Zheng Z,et al.The Drosophila Homolog of the Human Tumor Suppressor Gene BHD Interacts with the JAK-STAT and Dpp Signaling Pathways in Regulating Male Germline Stem Cell Maintenance [J].Oncogene,2006,25(44):5933-5941.

[11]Nookala R K,Langemeyer L,Pacitto A,et al.Crystal Structure of Folliculin Reveals a hidDENN Function in Genetically Inherited Renal cancer [J].Open Biol,2012,2(8):120071.

[12]Babu M M.Intrinsically disordered proteins [J].Molecular bioSystems,2012,8(1): 21.

[13]Marblestone J G,Edavettal S C,Lim Y,et al.Comparison of SUMO Fusion Technology with Traditional Gene Fusion Systems:Enhanced Expression and Solubility with SUMO [J].Protein science:a publication of the Protein Society,2006,15(1):182-189.