IVF助孕中卵母细胞成熟率对ICSI临床结局的影响

付蕾，朱玉林，袁景川，周莉，刘俊山，罗红，陶建芳，吴晓茜，孙梅

(石家庄市第四医院，石家庄 050000)

在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗周期中，控制性促排卵(COH)使多个卵泡发育，目的是获得适当的成熟卵母细胞(MⅡ卵母细胞)，实际临床工作中可能遇到卵母细胞成熟度不足或低下，直接关系到卵母细胞受精及胚胎发育，继而导致可移植胚胎数目少或无，并可能影响临床结局。因此寻找可能导致卵母细胞成熟度不足的因素，改善COH方案等可能有助于提高卵母细胞的质量及临床妊娠率。本研究通过回顾性分析 2014年3月至 2015年4月在本院生殖中心接受 ICSI 治疗的不孕患者 427例，探讨 HCG日各种监测指标等对卵母细胞成熟度的预测价值，及卵母细胞成熟度对胚胎发育潜能及妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

选取2014年3月至2015年4月在我院生殖中心行ICSI治疗的不孕患者的临床资料共427个周期。入选标准：(1)获卵数≥6 个；(2)基础血清卵泡刺激素(FSH)≤10 U/L；(3)不育原因为男性因素或伴有输卵管功能障碍。排除标准为：反复种植失败(既往 3 次及以上胚胎种植失败者)。根据取卵日脱颗粒细胞后卵母细胞成熟度(MⅡ卵母细胞数与卵母细胞数的比例)分为 A、B、C 三组，A组为成熟度≥80%，283个周期；B组成熟度为60%～79%，124个周期；C组成熟度<60%，20个周期。

二、方法

1.促排卵方案：患者均采用黄体期长方案，于前一周期的黄体中期(月经第21天)注射促性腺激素释放激素激动剂(注射用醋酸西曲瑞克，规格0.25 mg/支/次，Merck Serono，瑞士)，皮下注射，每日1次，月经第5～6天开始注射；月经来潮达到降调标准后注射卵泡刺激素(FSH，5.5 μg(75 U)/支，默克雪兰诺，瑞士)/人绝经期促性腺激素(HMG，75 U/支，丽珠制药)，月经第3天开始每日150 U～300 U，皮下注射；定期B超监测及血清LH、E2、孕酮(P)水平测定，根据卵泡生长情况，调整促性腺激素(Gn)剂量：当促排卵5～7 d卵泡发育不明显时，每日增加1支75 U的HMG，肌肉注射。

2.取卵：当B超下显示有1个卵泡直径≥18 mm、或2个卵泡直径≥17 mm或3个卵泡直径≥16 mm时，于当日21：00肌肉注射重组人绒毛膜促性腺激素(艾泽，Merck Serono S.p.A.，意大利)250 μg，36 h左右后在阴道B超引导下取卵。将卵泡液中卵冠丘复合物(OCCCs)捡出，置于IVF-30液(Vitrolife，瑞士)中漂洗3～4次去除红细胞，后移入含IVF-30液的卵母细胞培养皿中，置于5%～6% CO2培养箱预培养3～4 h，然后将OCCCs置于透明质酸酶中脱去周围颗粒细胞，于倒置显微镜下观察卵母细胞成熟状态。卵母细胞的卵周间隙内见第一极体为MⅡ卵母细胞，其余为未成熟卵母细胞，包括MⅠ和 GV期卵母细胞。

3.ICSI及胚胎培养：HCG注射后 38～42 h将MⅡ期卵母细胞进行ICSI，次日晨观察受精情况，是否出现原核及原核数，见到原核确定为受精，见到两个原核(2PN)确定为正常受精。受精后43～45 h观察卵裂情况，胚胎进一步发育为4～6细胞为正常卵裂，如停止发育为未卵裂。受精后 67～69 h再次观察，如卵裂球数目≥5个，大小较均匀，碎片比例<20%的胚胎为可移植胚胎。如卵裂球数目为8～10个，大小均匀，碎片比例<5%的胚胎为优质胚胎。

4.胚胎移植：移植后14 d检查血清HCG，4～5周后阴道B超检，见查宫内胎囊及胎心搏动为临床妊娠。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；累积临床妊娠率=新鲜周期胚胎移植和冻融胚胎移植后获得临床妊娠的周期数/总取卵周期数×100%。

三、统计学方法

结 果

一、临床资料

在427个周期中，A组、B组、C 组分别占 66.28%、29.04%、4.68%。三组的年龄、不育年限、基础FSH和AMH水平均无统计学差异P>0.05。A组、B组Gn天数及用量少于C组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

二、三组患者HCG日激素水平

HCG日血清E2：A组>B组>C组，两两比较有统计学差异(P<0.05)。HCG日血清LH、P，三组间无统计学差异(P>0.05)。每成熟卵母细胞E2水平(血清E2/≥14 mm卵泡数)：三组间无统计学差异(P>0.05)。每卵母细胞E2水平(血清E2/获卵数)：三组间无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表1 三组患者一般情况比较(-±s)

注：与A组、B组比较，*P<0.05

表2 三组患者HCG日激素水平比较

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05

三、三组患者获卵情况

成熟卵泡数、获卵数、MⅡ卵数：A组>B组>C组，两两比较有统计学差异(P<0.05)。获卵率(获卵数/≥14 mm卵泡数)：A组大于B组和C组，差异有统计学意义(P<0.05)，B组、C组比较获卵率无统计学差异(P>0.05)。≥18 mm卵泡数/≥14 mm卵泡数：C组>A组和B组，差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

四、三组患者胚胎发育及临床结局情况

正常受精率(2PN数/MⅡ卵数)：A组大于B组和C组，有统计学差异(P<0.05)，B组、C组卵裂率无统计学差异(P>0.05)。卵裂率(2PN卵裂数/2PN数)：A组大于B组和C组，有统计学差异(P<0.05)，B组、C组卵裂率无统计学差异(P>0.05)。可移植胚胎率(可移植胚胎数/卵裂数)：三组间无统计学差异(P>0.05)。优胚率(优质胚胎数/可移植胚胎数)：A组大于B组和C组，有统计学差异(P<0.05)，A组、B组优胚率无统计学差异(P>0.05)。累积妊娠率：A组和B组大于C组，有统计学差异(P<0.05)，A组、B组累积妊娠率无统计学差异(P>0.05)。中重度卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生率：三组间无统计学差异(P>0.05)(表4)。

表3 三组患者获卵情况比较[(-±s)，%]

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05

表4 三组患者胚胎发育及临床结局的比较(%)

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05

讨 论

在COH过程中，对于卵巢储备功能正常的患者通常采用黄体期长方案，可抑制早发LH峰，有利于提高卵泡发育的同步性。本研究所选对象均为长方案。随着卵母细胞成熟度的增加，三组患者≥14 mm卵泡数、获卵数、成熟卵数增加，A组分别为16.12，16.04，14.31；B组分别为14.80，14.25，10.35；C组分别为11.50，10.95，5.70；C组的Gn天数[(13.65±3.08)d vs.(12.46±2.27)d、(12.23±1.78)d]、Gn用量[(3 365.00±1 125.930)U vs.(2 113.96±976.55)U、(2 779.23±1 098.21)U]均显著高于A组、B组。提示Gn用药时间长、Gn用量较大而成熟卵数及获卵数相对少(<10个)的患者易发生卵母细胞成熟度不足。李莉等[1]的研究也显示HCG日≥14 mm卵泡数和获卵数少于10个应警惕发生卵母细胞成熟度低下。

在自然周期中，单个优势卵泡的发育，可使血清 E2水平达到1 098 pmol/L左右，在COH中，外源性Gn刺激多卵泡同时发育，继而产生相应倍数的血清E2[2]。HCG注射日高水平的E2，与获卵数有直接关系[3]。三组患者随着成熟卵泡数、获卵数及成熟卵数的增加，血清E2也相应增加，但三组每成熟卵泡E2水平、每获卵数E2水平无统计学差异。三组中HCG日>18 mm占成熟卵泡的比例，C组(47.82%)较A(43.87%)、B(44.12%)两组高，但差异无统计学意义，说明三组注射HCG的标准较一致。原因可能为：(1)与促排卵过程有关，如垂体-卵巢轴过度抑制导致卵巢对Gn的敏感性下降，卵巢反应低下，卵泡发育不均，Gn用量增加，卵母细胞质量下降。(2)HCG注射时机：如时间太早，颗粒细胞的LH受体不足，对HCG反应不足，导致卵丘小且紧附卵泡壁，不易抽吸，回收卵母细胞少，且所获卵大多是不成熟卵母细胞，受精率降低，也可促使卵泡闭锁。若注射 HCG太迟，卵泡过熟，成熟卵泡内卵母细胞丢失，小卵泡内获得未成熟卵。(3)可能是由于卵巢反应不良或多囊卵巢综合征(PCOS) 引起。Sachs等[4]的研究认为高反应的患者易产生较多的未成熟卵。C组可能为卵巢反应不良或对Gn敏感性下降，卵泡发育不均，HCG注射日大部分为中小卵泡，获卵数及成熟卵数低，若推迟HCG时间，可能导致Gn用量的增加，并可能增加OHSS的风险。

本研究A组的2PN受精率(86.55% vs.78.19% vs.79.82%)、卵裂率(99.17% vs.97.91% vs.95.60%)显著高于B、C组；A组、B组的优胚率(48.03% vs.44.58% vs.39.62%)显著高于C组，虽然A组>B组，但差异无统计学意义。囊胚形成率：A组>B组>C组，但差异无统计学意义，说明卵母细胞成熟度是影响胚胎发育潜能的主要因素之一。夏兰等[5]的研究显示MⅡ卵母细胞数与HCG日14 mm以上卵泡数的比率≤50%，成熟度降低，受精率及优胚率均降低；蒋益群等[6]也认为ICSI 周期中，未成熟卵母细胞比例过高(≥50%)可能影响胚胎的发育潜能及临床结局。优质的卵母细胞是细胞核和细胞质的同步成熟。只有胞核和胞质同步成熟的卵母细胞才具备良好的受精及胚胎发育的潜能[7]。生发泡的破裂及第一极体排出只代表卵母细胞核的成熟，而细胞质未必成熟，Combelles等[8]认为，胞质的成熟创造了良好的代谢环境，蛋白质磷酸化和去磷酸化的完成以及细胞器的结构重组和重新分布，提供卵母细胞所需能量，使卵母细胞正常受精、卵裂及囊胚形成。另外卵母细胞在前三个细胞周期的合成代谢也是由贮存于细胞质中的 RNA及蛋白质完成的，所以胞质的成熟是受精及胚胎发育的一个重要因素。在胞质未成熟时过早授精，可能影响受精及胚胎发育。A组、B组的累积妊娠率高于C组(51.59%、48.38% vs.35.00%)，差异有统计学意义；虽然A组>B组，但差异无统计学意义。原因可能为A、B两组有较多的可移植的胚胎，可供多次冻融胚胎移植，而C组可供移植的胚胎数少。卵泡发育的整个过程都受到促排卵药物的影响，大剂量Gn可能对卵母细胞减数分裂、发育潜能和表观遗传修饰有影响。Meng等[9]的研究显示COH过程会降低小鼠卵母细胞水通道蛋白3的表达以及胚胎的发育潜能。

足够且优质的卵母细胞是IVF成功的基础。Gn用量较多且HCG日≥14 mm卵泡数和获卵数少于10个的患者易发生卵母细胞成熟度不足，可能影响受精及发育潜能，将导致可供移植的胚胎数减少，影响妊娠率[9-11]。调整促排卵药物及用量或改变促排卵方案可能改善部分患者的卵母细胞成熟度[12]。对于卵巢反应不良及卵巢低反应的患者，可采用 IVF+未成熟卵体外培养(IVM)[13-14]，充分利用优势卵泡和小卵泡中的卵母细胞，李建华等[15]于 2013年报道了行自然周期成熟卵和IVM获得的胚胎经冻融435例，妊娠率达 38.2%；对于PCOS患者，通过 IVM 方式增加获卵数和避免OHSS风险。许薇等[16]于 2010年报道了170例PCOS、PCO等患者行IVM的妊娠结局，妊娠率 21.12%，流产率41.67%，更好的培养环境是IVM良好妊娠结局的保证。

本研究以本生殖中心行ICSI 治疗的427例不孕患者为研究对象，探究影响HCG日卵母细胞成熟度的临床因素，及卵母细胞成熟度对胚胎发育潜能及妊娠结局的影响。结果提示年龄、不育年限、HCG日血清LH、P、成熟卵母细胞E2水平、卵母细胞E2水平等因素无统计学差异；成熟卵泡数、获卵数、MⅡ卵数、正常受精率、卵裂率、优胚率、累积妊娠率等因素有统计学意义(P<0.05)。可见，卵母细胞成熟度与胚胎质量存在密切关系，并且卵母细胞成熟率低可能与卵巢反应不良或对Gn敏感性下降有关。因此，卵母细胞成熟率低可能影响受精及胚胎发育潜能，导致可供移植的胚胎数减少，从而影响妊娠率。

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