苏木水提物抗蛇毒磷脂酶A2活性研究

乐贞 陈旭明 姚水洪 冯敬骞 朱晓萍 陈敏

【摘  要】 中药苏木（Sappan Lignum）来源于植物苏木（Caesalpinia sappan L.）的干燥心材，具有止血抗炎等功效。采用琼脂糖平板法研究不同浓度的苏木水提物（0.03g/ml，0.06g/ml，0.09g/ml，0.12g/ml，0.15g/ml）对蛇毒sPLA2水解活性的抑制作用，测量透明圈和孔的直径，根据酶活标准曲线计算其抑制率。结果表明0.15g/ml苏木水提物对五步蛇毒sPLA2水解活性有抑制作用。

【关键词】 苏木;五步蛇毒;抗蛇毒活性

Study on the water extract of Sappa Lignum against the activity of phospholipase A2 from Snake Venom

Le Zhen *   Chen Xuming   Yao Shuihong   Feng Jingqian   Zhu Xiaoping   Chen Min

（QuZhou College of Technology ZheJiang     324000）

[Abstract] The traditional Chinese medicine Sappan Lignum is derived from the dry heartwood of the plant Caesalpinia sappan L. It has the effect of hemostasis and anti-inflammation. Agarose plate method was used to study the inhibitory effect of  the water extract of  Sappa Lignum （0.03g / ml， 0.06g / ml， 0.09 g / ml， 0.12g / ml， 0.15g / ml） on the hydrolysis activity of snake venom sPLA2. The diameter of transparent circle and pore were measured and the inhibition rate was calculated according to the standard curve of enzyme activity. The results show that the water extract of 0.15g/ml has the inhibitory activity against the hydrolysis activity of sPLA2 from the venom of Agkistrodon acutus.

[Keywords] sappan lignum; agkistrodon acutus venom; antivenom activity

毒蛇咬伤致残致死率非常高，且每年被毒蛇咬伤案例时常发生。蛇伤患者最常见的症状是发生炎症反应，产生大量的炎症因子，如IL-6，TNF-α等。sPLA2是蛇毒酶中主要组分之一，sPLA2在人和动物体内能诱导产生大量的炎症因子，进一步激活下游的炎症反应[1-3]。

南美响尾蛇 sPLA2可引起膜磷脂释放花生四烯酸，引起中毒后炎症反应。该sPLA2可被黄酮类化合物橡黄素（quercetin）化学修饰而失活。而且黄酮类的苯并吡喃酮环还可以与PLA2上酶活性位点附近的Phe5， Trp31和Phe98结合[4]。

中药苏木（ Sappan Lignum）为豆科云实属（也称为苏木科）植物苏木（ Caesalpinia sappan L. ） 的干燥心材， 又名苏方木[5]。其药理作用主要是活血祛瘀、抗肿瘤、抗氧化、消炎止痛等[6]。其特征性成分之一为高异黄酮类化合物，主要以苷元形式存在，还富含有其他黄酮类化合物，苏木为小乔木，药用部位为心材，这个部位常以次生代谢物苷元为主，高异黄酮类化合物可能是其主要药效物质[7-8]。目前国内对于苏木科药用植物抗蛇毒sPLA2活性研究尚少，本文旨在研究我国境内苏木抗蛇毒sPLA2的活性，为从中草药中开发抗蛇毒药物提供依据。

1  材料与方法

1.1 材料与试剂

中药苏木（上饶爱心大药房），五步蛇蛇毒冻干粉（黄山蛇毒厂），Source 30Q阴离子交换色谱填料（GE公司），0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），低分子量蛋白质Marker14.4kDa-97.4kDa、考马斯亮蓝G-250（北京索莱宝公司），SDS（十二烷基磺酸钠）、Bis（甲叉双丙烯酰胺）、Acr（聚丙烯酰胺）、Tris碱、甘氨酸、TEMED（四甲基乙二胺）、AP（过硫酸胺）（sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 苏木水提物的制备  苏木适当粉碎后加适量双蒸水，浸泡3小时，煮沸提取60min，收集滤液，药渣再加水煮30min。合并二次药液，置4℃过夜，滤清，水浴干燥。称取干燥提取物3g、6g、9g、12g、15g分别加入100ml双蒸水，加热使完全溶解，分装，高压蒸气灭菌供实验用。配制成生药含量为0.03g/ml，0.06g/ml，0.09g/ml，0.12g/ml，0.15g/ml的蘇木药液。4℃保存备用。

1.2.2蛇毒的制备  取五步蛇蛇毒冻干粉，用0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）为溶剂，配制成1mg/mL蛇毒样品，置于4℃过夜溶解，次日离心1，000rpm，10min后，取上清，4℃保存备用。

1.2.3 蛇毒sPLA2的分离纯化   采用阴离子交换进行纯化，柱填料为Source 30Q，体积为7ml，使用流动相A（20mM Tris-Hcl ，PH8.0）平衡柱15min，2ml/min。取1.2.2制备的蛇毒样品过柱，流速为2ml/min;流动相A继续平衡柱，2ml/min。 使用流动相B（20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，PH8.0）以4ml/min的流速分别于10%、20%、30%、40%、60%、80%、100%阶段洗脱蛋白，在A280nm监测下收集洗脱峰。SDS凝胶检测蛇毒sPLA2组分，运用Quantity One软件扫描WB胶片，以蛋白灰度值作为实验结果指标。

1.2.4 蛇毒sPLA2纯化后各组分活性检测  制备琼脂糖平板[9]，准备9cm玻璃平皿，取700μl蛋黄母液与470μl 0.01mol/L CaCl2先在平皿里混匀。将工作缓冲液重新加热溶解，待冷却至60℃左右加入上述混合液中，至平板1/3高度即可。用塑料管直立插入溶液进行打孔;形成凝胶后，孔即成形，拔出塑料管，清理孔内凝胶。取1.2.3五步蛇毒sPLA2分离纯化后的各个组分80ul，加入各孔内，蛇毒sPLA210 μl与70 μl生理盐水混匀作为阳性对照，80ul生理盐水作为阴性对照。37℃放置5h，观察透明圈大小。选取水解活性最大的组分作为靶酶。

1.2.5 蛇毒sPLA2的酶活标准曲线  制备琼脂糖平板，将1.2.4水解活性最强的蛇毒sPLA2（1mg/ml），依次稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，依次取蛇毒sPLA2及稀释后的溶液10μl与30μl的20mM Tris-HCl（PH8.0）混合，并分别加入至琼脂糖平板的孔内，以40μl的20mM Tris-HCl（PH8.0）作为空白对照。将平板置于37℃孵育5h，测量每组孔的透明圈直径长度（d）。利用软件Graph Pad 5.0分析数据，以每孔sPLA2质量为横坐标，相应的透明圈体积为纵坐标，绘制五步蛇和眼镜蛇sPLA2的酶活标准曲线及得出其函数方程式。

1.2.6 抗蛇毒磷脂酶A2水解活性  采用琼脂糖平板法检测苏木水提物对蛇毒sPLA2的抑制活性。取蛇毒sPLA210 μl与不同浓度0.03g/ml、0.06g/ml、0.09g/ml、0.12g/ml、0.15g/ml的苏木水提物30 μl混匀，加入各孔内，蛇毒10 μl与30 μl生理盐水混匀作为阳性对照组，40ul生理盐水作为阴性对照组。37℃放置5h，测量透明圈直径大小。依据五步蛇毒sPLA2的曲线函数，计算PLIγ的抑制率。

2  结果与分析

2.1  蛇毒sPLA2的分离纯化及活性检测

如图1.A所示，五步蛇毒经纯化后，共收集到6个洗脱峰：F1、F2、F3、F4、F5、F6。图1.B SDS凝胶考马斯亮蓝染色显示，它们均含有sPLA2，运用Quantity One软件扫描WB胶片，以蛋白灰度值作为实验结果指标，F4含量最高。且琼脂糖平板结果同时显示F4活性最大（见图1.C），因此将F4作为靶酶。

（A）五步蛇sPLA2纯化，F1-F6分别为洗脱得到的蛇毒组份。（B）SDS凝胶检测五步蛇sPLA2分离纯化后各组分，从左至右依次是F1-F6。（C） 琼脂糖平板检测五步蛇sPLA2活性，F1-F6分别为不同浓度NaCl洗脱的蛇毒组份，F0为生理盐水作为空白对照组。

2.2  蛇毒sPLA2的酶活标准曲线

按照1.2.5方法依次取F4（1mg/ml）及稀释后的溶液10μl，即sPLA2质量分别为10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.3125μg，经琼脂糖平板孵育8小时后，测量得到它们的透明圈直径长度。以每孔sPLA2质量为横坐标，与它们相对应的透明圈体积（cm3）为纵坐标，利用软件Graph Pad 5.0绘制五步蛇sPLA2的酶活标准曲线（图2.B），得到函数方程：

（A） 五步蛇毒sPLA2不同浓度的水解活性。0为生理盐水阴性对照组，1-6分别为0.3125ug、0.625ug、1.25ug、2.5ug、5ug、10ugsPLA2酶水解活性。（B）五步蛇毒组份F4的sPLA2酶活标准曲线。（C） 五步蛇组份F4的对数与透明圈面积的线性趋势。

2.3  苏木水提物对五步蛇蛇毒sPLA2的抑制活性

Source 30Q分离纯化后的蛇毒sPLA2经Bradford法检测，浓度为500μg /ml，其抑制五步蛇sPLA2酶活性的结果如图3所示，阴性对照组（生理盐水）无透明圈，实验组6（sPLA2+0.15g/ml苏木水提物）的透明圈小于阳性对照组，但抑制效果不显著。实验组2-5与阳性对照组无明显差别，无抑制活性。根据透明圈直径和五步蛇sPLA2酶活曲线的函数方程，计算得抑制率为30%。

0：40ul生理盐水，1：10ul蛇毒sPLA2，2-6：分别为10ul蛇毒sPLA2和30ul不同浓度的苏木水提物，其浓度依次为0.03g/ml，0.06g/ml，0.09g/ml，0.12g/ml，0.15g/ml。

3  讨论

通过琼脂糖平板实验，研究发现苏木水提物对五步蛇毒sPLA2的抑制活性不显著，或许是因为苏木水提物成分复杂，未经分离纯化，导致有抑制活性的成分含量过低。此外郭春风等[10]发现苏木乙酸乙酯提取物对慢性柯萨奇病毒性心肌炎的治疗作用。苏木通过降低外周血中TNF-α水平，抑制心肌炎免疫损伤，保护心肌细胞。Washiyama等[11]從苏木醇提物中分离到巴西苏木素、苏木查尔酮，原苏木素 D 及原苏木素 E 等化学成分，发现苏木查尔酮，原苏木素D及原苏木素E则对NO，PGE2，TNF-α，IL-6，COX-2等均有抑制作用。可见苏木的抗炎作用是多种成分相互作用的结果。而苏木水提物对五步蛇毒sPLA2所表现出的抑制活性，是否是因为其黄酮类化合物与sPLA2之间的相互作用，有待实验进一步研究。

参考文献：

[1] Moreira V， de Castro Souto PCM， Ramirez Vinolo MA， et al.        A catalytically-inactive snake venom Lys49 phospholipase           A2 homolog induces expression of cyclooxygenase-2 and pro        duction of prostaglandins through selected signaling pathways      in macrophages. European Journal of Pharmacology 2013，              708： 68-79.

[2] Wei J-F， Wei X-l， Chen Q-Y， et al. Induction of inflammato       ry cell accumulation by TM-N49 and promutoxin， two novel         phospholipase A2. Toxicon 2010， 56：580-588.

[3] Zuliani JP， Fernandes CM， Zamuner SR， et al. Inflammatory         events induced by Lys-49 and Asp-49 phospholipases A2           isolated from Bothrops asper snake venom： role of catalytic           activity. Toxicon 2005， 45：335-346.

[4] Da Silva SL， Calgarotto AK， Chaar JS， et al. Isolation and              characterization of ellagic acid derivatives isolated from Case        aria sylvestris SW aqueous extract with anti-PLA（2） activity.        Toxicon 2008， 52：655-666.

[5] Flora Republicae Popularis Sinicae（中國植物志）. Beijing：sci       ence press，1986，39：105.

[6] 王振月，王宗权，周亚滨，李春燕.苏木化学成分的研究             （Ⅰ）[J].天然产物研究与开发.2010，22：590-593.

[7] 张 琼，刘雪婷，梁敬钰.云实的化学成分[J].中国天然药物，      2008，6（3）：168-171.

[8] 蔡晨秋.苏木的化学成分研究[D].北京：中央民族大学，             2012：56

[9] Garcia Denegri ME， Acosta OC， Huancahuire-Vega S， et al.         Isolation and functional characterization of a new acidic PLA        （2） Ba SpII RP4 of the Bothrops alternatus snake venom from         Argentina. Toxicon 2010， 56：64-74.

[10] 郭春风，周亚滨，陈会君，等.苏木乙酸乙酯提取物对慢         性柯萨奇病毒性心肌炎小鼠外周血中 TNF-α 的影响[J]        .中医药学报，2014，42（ 5） ： 18-20.

[11] WASHIYAMA M，SASAKI Y，HOSOKAWA T，et al.An            ti-inflammatory constituents of Sappan Lignum.[J].Biol            Pharm Bull，2009，32（ 5） ： 941-944.