6种香料植物提取物对荞麦立枯病菌的抑制作用

唐晓慧，钟灵允，汤 焘，李文飞，李 兴，江 兰 ，赵 钢，赵江林*

(1.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都 610106；2.成都大学 农业部杂粮加工重点实验室，四川 成都 610106)

荞麦(Buckwheat)是一种著名的药食同源小宗杂粮作物，富含蛋白质、脂肪、淀粉、矿质微量元素、生物黄酮和D-手性肌醇等营养功能成分，具有很好的营养保健功能和经济价值[1-2]。随着人民生活水平的提高，饮食结构的改善和健康意识的增强，兼具营养与保健功效的荞麦及其加工制品深受消费者的喜爱[3-5]。近年来，随着我国荞麦种植面积的不断扩大，荞麦病害的发生也呈逐年加重趋势，其中由半知菌类丝核菌属立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的荞麦立枯病害尤为突出，可导致荞麦年产量损失高达15%～20%，严重影响了荞麦的产量和品质[6-7]。当前在荞麦种植生产过程中，主要通过施用多菌灵、代森锌、福美双和克菌丹可湿性粉剂等化学类农药来防治荞麦立枯病害[7-8]。随着长期大量使用这些化学类药剂，势必会引起病原微生物的抗性增强、毒性残留，以及环境污染等弊端，因而急需探寻一些新型高效、低毒、环境友好的杀菌药物作为替代。植物源杀菌剂作为现代生物农药的一部分，以其低毒、选择性高、易降解等独特优势，具有广阔的开发利用前景[9-11]。本文研究了6种香料植物提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制作用，以期筛选出具有较强抑菌活性的香料提取物，为荞麦立枯病等病害新型植物源防治药剂的开发研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验原料 八角(IlliciumverumHook.f.)、花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)、辣椒(CapsicumannuumL.)、生姜(ZingiberofficinaleRosc.)、大蒜(AlliumsativumL.)、葱(AlliumfistulosumL.)，市售。马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA(马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，水1 000 mL)，95%乙醇(成都金山化学试剂有限公司)，多菌灵(Aldrich公司)。

1.1.2 供试病原菌 荞麦立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)RS-1(GenBank登录号：KP027485)，由成都大学-农业部杂粮加工重点实验室菌种保藏中心提供。实验前活化使用，将其接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，放入28.5 ℃恒温培养箱中，培养3～5 d即可。

1.1.3 实验仪器 DFT-100手提式高速万能粉碎机；ESJ120-4电子天平；DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱；SHZ-95B循环水式多用真空泵；R-201旋转蒸发器；W201恒温水浴锅；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅；超净工作台；RXZ-PQX人工气候箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 香料植物提取物的制备 原料前处理：将生姜清洗、沥水、切块；把鲜葱去根须、清洗、沥水、切碎；将大蒜清洗、沥水、去皮；采用组织匀浆机对生姜块、鲜葱粒、大蒜瓣进行粉碎，分别得到生姜、葱和大蒜匀浆，将其置于4 ℃冰箱保存，待用。辣椒、花椒和八角经挑选、除杂，然后将其置于50～55 ℃干燥箱中烘焙60 min后取出，采用万能粉碎机分别将其磨碎，过80目筛，分别得到辣椒、花椒和八角粉末，将其装入密封袋，置于4 ℃冰箱保存，待用。

乙醇提取物的制备：分别称取各香料植物粉末或匀浆200.0 g，置于1 000 mL锥形瓶中，按照料液比1∶4(m/v)加入体积分数95%乙醇，在50 ℃超声辅助浸提60 min，过滤除杂，每种植物样品提取2次，合并2次滤液，然后采用旋转蒸发仪对各滤液进行浓缩至近干，转入蒸发皿，置于50 ℃恒温干燥箱中烘干至恒质量，称量，得到6种香料植物的乙醇提取物。

1.2.2 提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法(mycelia growth rate)初步检测提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制作用[12]。用分析天平分别准确称取4.0 g各香料提取物，用20%的乙醇溶液将各提取物充分溶解，制成0.4 g/mL母液。然后分别移取0.5,0.25,0.125,0.062 5 mL各配制好的母液加入盛有50.0 mL马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的锥形瓶中，制成浓度为4.0,2.0,1.0,0.5 g/L的带药培养基，倒皿，待冷却后在培养皿中央移入荞麦立枯丝核病菌菌饼(Φ=7 mm)，每皿1个，每个处理3次重复。以蒸馏水为空白对照(CK)，0.2%乙醇为阴性对照(CK-)，20.0 mg/L多菌灵为阳性对照(CK+)。随后将培养皿置于28.5 ℃恒温培养箱中进行暗培养，48 h后采用十字交叉法测量菌落直径大小，并根据以下公式计算抑制率。

菌落扩展直径(mm)=菌落平均直径(mm)-菌饼直径(7 mm)

(1)

抑制率=(溶剂对照菌落扩展直径 -处理菌落扩展直径)/ 溶剂对照菌落扩展直径×100%

(2)

1.2.3 提取物对立枯病菌菌丝生长抑制中浓度IC50值的测定 采用菌丝生长速率法测定提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制中浓度IC50值。在活性初筛基础之上，选取对荞麦立枯病菌菌丝生长具有较好抑制作用的几种香料植物提取物进行IC50值的测定。将4种香料植物提取物分别配制为生姜(0.125,0.25,0.5,1.0,2.0 g/L)、八角(0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 g/L)、辣椒(1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 g/L)和花椒(0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 g/L)的各系列浓度带药培养基，其活性测定操作方法同上。根据所测定的菌落直径大小，计算出各样品对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制率。在试验数据分析中，将香料植物提取物浓度(g/L)换算成浓度对数(X)，抑制率换算成生物统计几率值(Y)，并求得其相关回归方程Y=aX+ b，根据线性方程从而求得抑制中浓度IC50值[13]。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)19.0统计软件和Microsoft Office Excel 2003进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 6种香料植物提取物得率

采用超声波辅助浸提结合真空浓缩的方法对辣椒、花椒、八角、大蒜、生姜和葱等6种香料植物的乙醇浸提物进行了提取制备。不同香料植物的乙醇提取物得率有较大差异，其得率如表1所示。6种香料植物中大蒜的乙醇提取物得率相对较高，提取率达到24.4%，其次为辣椒、花椒、八角和葱，其得率分别为18.9%，18.1%，12.1%和7.1%，而生姜的乙醇提取物得率相对最低，仅为2.7%。

表1 6种香料植物乙醇提取物得率

2.2 6种香料植物提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制作用

本研究采用菌丝生长速率法检测了辣椒、花椒、八角、大蒜、生姜和葱等6种香辛料植物乙醇提取物对荞麦立枯病菌(Rhizoctoniasolani)RS-1菌丝生长的抑制作用，其代表性抑制效果如图1所示。

CK：水；CK-：0.2%乙醇；CK+：20.0 mg/L多菌灵；A：生姜；B：八角；C：辣椒；D：葱；E：大蒜；F：花椒CK：water;CK-：0.2% ethanol;CK+：20.0 mg/L carbendazim;A：Zingiber officinale:B：Illicium verum;C：Capsicum annuum;D：Allium fistulosum;E：Allium sativum;F：Zanthoxylum bungeanum图1 6种香料植物提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of six kinds of plant extracts on the mycelia growth of R.solani

植物提取物Plantextract浓度/(g·L-1)Concentration菌落直径/mmColonydiameter抑制率/%Inhibitoryactivity辣椒0．566．4±1．9bc8．4±1．9lmCapsicumannuum1．061．0±1．5ef15．9±1．8ij2．049．8±1．8h31．2±2．0g4．041．8±2．0i42．4±2．8f花椒0．553．4±1．8g26．3±2．3hZanthoxylumbungeanum1．033．3±0．8k54．0±0．8d2．026．3±1．2l63．7±1．6c4．017．9±0．4m75．3±0．6b八角0．567．3±0．5bc7．1±0．3lmIlliciumverum1．059．1±3．4f18．5±2．4i2．038．0±0．5j47．6±0．7e4．025．3±0．8l65．2±1．1c大蒜0．569．2±0．8b4．6±0．5mAlliumsativum1．067．3±2．5bc7．1±2．8lm2．064．7±1．0cd10．8±1．4kl4．062．3±1．0de14．0±0．6jk生姜0．540．5±0．9ij44．1±0．9efZingiberofficinale1．033．7±1．5k53．6±1．5d2．025．3±1．5l65．1±1．9c4．017．3±1．8m76．1±1．5b葱0．568．5±2．4b5．5±2．7mAlliumfistulosum1．068．0±3．5b6．2±1．8m2．067．4±0．8bc7．0±0．5lm4．066．5±3．0bc8．3±3．7lm阳性对照CK+0．0±0．0n100．0±0．0a溶剂对照CK-72．5±3．3a空白对照CK74．6±0．9a

数值代表平均数±标准差(n=3)，不同列中的不同字母(a-n)表示在P=0.05水平上有显著差异。

The values represent means±standard deviation(n=3),different letters(i.e.,a-n) in each column indicated significant differences among the treatments atP=0.05 level.

不同浓度的各香料植物乙醇提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制率如表2所示。在供试质量浓度(0.5～4.0 g/L)范围内，这几种香料提取物对荞麦立枯病菌的生长均表现出了一定的抑制效果，其活性大小与提取物类型及处理浓度紧密相关。6种香料提取物中，生姜和花椒乙醇提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制活性相对较强，其抑制率分别可达44.1%～76.1%和26.3%～75.3%。八角和辣椒乙醇提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长表现出了一定的抑制活性，在最高浓度4.0 g/L时，其对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制率分别为65.2%和42.4%。而葱和大蒜的乙醇提取物在供试浓度范围内对荞麦立枯病菌的抑制作用相对较弱，其抑制率均小于15.0%。

2.3 香辛料提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制中浓度IC50值

根据抑菌活性初筛结果，6种香辛料植物中生姜、花椒、八角和辣椒的乙醇提取物对荞麦立枯病菌表现出了较好的抑制作用，值得深入研究。基于此，选用菌丝生长速率法进一步测定了该4种香料植物提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制中浓度IC50值，旨在为其开发利用提供依据。以香料植物提取物对立枯病菌RS-1菌丝生长的抑制率-几率值为纵坐标，提取物浓度对数为横坐标，分别构建其线性回归方程，进而分析计算各香料植物乙醇提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的IC50值。图2(A、B、C、D)分别呈现了生姜、八角、辣椒和花椒4种香料提取物浓度对数与其对荞麦枯立病菌菌丝生长抑制活性的相关曲线图。在供试浓度范围内，这4种香料植物乙醇提取物对立枯丝核病菌RS-1的抑制活性呈现一定的量效关系，其浓度-活性线性关系良好(R≥0.994 3)。

图2 生姜(A)、八角(B)、辣椒(C)和花椒(D)提取物浓度与其对荞麦立枯病菌抑制活性相关曲线图Fig.2 Diagrams of correlations between the extract concentration of A.sativum(A),I.verum (B),C.annuum(C) and Z.bungeanum (D) ant their inhibitory activity against R.solani

香料植物Spiceplant抑制活性回归方程Regressequationandcorrelationcoefficient抑制中浓度/(g·L-1)IC50生姜Y=0．8799X+2．4804 R=0．99730．73八角Y=1．9120X-1．4770 R=0．99612．44辣椒Y=1．6027X-1．0084 R=0．99435．61花椒Y=1．3292X+1．0361 R=0．99700．96

由表3可以看出，生姜、八角、辣椒和花椒4种香料乙醇提取物中，生姜提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制活性最好，其抑制中浓度IC50值仅为0.73 g/L。花椒提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制作用次之，其IC50值为0.96 g/L。八角提取物对荞麦立枯病菌抑制作用的IC50值为2.44 g/L。而辣椒提取物对荞麦立枯病菌RS-1的抑制活性相对较弱，其IC50值高达5.61 g/L。

3 结论与讨论

荞麦立枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的一种土传性真菌病害。该病菌主要在荞麦幼苗期危害地下种子或幼苗茎基部，引起缺苗断垄或幼苗萎蔫枯死。立枯丝核病菌主要以菌丝体和菌核在土壤或荞麦残体上越冬，可在土中腐生2～3年。该病菌也可通过雨水、灌溉水、气流和农具等进行传播，从幼苗茎基部或根部伤口侵入，也可直接穿透荞麦表皮侵入[6-7]。如何有效控制和减少荞麦立枯病等病害的发生？这对于提高荞麦产量与品质，保障食品安全，带动荞麦种植地区经济发展具有重要意义。因此，本研究选用菌丝生长速率法检测了6种香料植物乙醇提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制作用。在供试浓度范围内，这几种香料植物提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长表现出了一定的抑制效果，其活性大小与提取物类型及处理浓度紧密相关，并呈现一定的量效关系。在浓度为1.0 g/L时，生姜和花椒乙醇提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制率超过了50%，而大蒜和葱提取物对立枯病菌菌丝生长的抑制率均低于10%。随着供试浓度的升高，这几种香料提取物对立枯病菌的抑制活性均有所增强。当提取物浓度达到4.0 g/L时，生姜和花椒提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制率分别高达76.1%和75.3%，八角和辣椒提取物对立枯病菌菌丝生长的抑制率为65.2%和42.4%，大蒜和葱提取物对立枯病菌菌丝生长的抑制率仅为14.0%和8.3%。进一步通过活性测定分析得到生姜和花椒提取物对荞麦立枯病菌菌丝生长的抑制中浓度IC50值为0.73 g/L和0.96 g/L，八角提取物对荞麦立枯病菌抑制作用的IC50值为2.44 g/L，而辣椒提取物对荞麦立枯病菌抑制活性相对较弱，其IC50值为5.61 g/L。

众多研究[14-19]报道，香料植物大多具有较好的抑菌作用，其在农业、医药业和食品工业等领域具有广阔的开发利用前景。本研究结果表明生姜和花椒提取物能够有效地抑制荞麦立枯病菌菌丝生长，说明生姜和花椒2种香料植物体内的有效成分对立枯丝核病菌具有较强的抑菌作用，展现出了较好的开发研究价值。然而这些提取物及有效成分的理化性质、抑菌作用机制，以及生防效果等方面有待进一步深入研究，以期为荞麦立枯病等病害新型防治药剂的开发研制提供依据。

致谢:成都大学药学与生物工程学院向达兵博士对本研究给与了指导和帮助，谨致谢意！

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