去铁胺促进血管内皮祖细胞靶向归巢和血管化的实验研究

郑胜武 黄雄梅 庄兢 林根辉 杨宇 丁昕

[摘要]目的：探討低氧模拟剂去铁胺（Desferrioxamine，DFO）模拟组织缺氧环境，促进血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）靶向归巢及促进血管化的可行性，并研究相关的信号通路。方法：分离、培养荧光素酶（luciferase）转基因Lewis大鼠的EPCs，作为移植细胞备用。实验动物NOD/SCID裸鼠被随机分为五组：对照组、EPCs、EPCs-DFO、EPCs-DFO-AMD （AMD3100，趋化因子受体CXCR4抑制剂）、EPCs-DFO-LY（LY294002，磷酸肌醇3激酶（PI3K）抑制剂）组，每组10只。通过结扎裸鼠左侧股动脉造成左下肢缺血，经患侧股动脉移植EPCs，不同组别分别腹腔注射DFO（100mg/kg/d）、DFO和AMD3100（10mg/kg/d）、DFO和LY294002（20mg/kg/d），连续14d。分别从组织学，分子生物学，细胞学3个方面评价实验结果。结果：DFO的使用增加了裸鼠缺血下肢的血流灌注，改善了缺血下肢的功能，其新生毛细血管数量明显高于其他组，并且通过Western Blot检测观察到缺血组织中VEGF（血管内皮生长因子），p-eNOS（磷酸化的一氧化氮合酶）和p-AKT（磷酸化蛋白激酶B）的分泌显著上调。在生物发光成像的研究中，DFO显著增加了EPCs向缺血患肢的迁移。这些作用均被PI3K抑制剂LY294002所抑制。结论：DFO的使用上调了EPCs向缺血患肢的迁移，改善了缺血患肢的血流灌注以及下肢功能，上调促血管生成因子的分泌，促进缺血组织的血管化，这些作用通过PI3K/AKT信号转导通路。

[关键词]低氧模拟剂；低氧诱导因子；内皮祖细胞；归巢；血管化；PI3K/AKT信号通路

[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）12-0116-05

DFO Improves the Homing of EPCs and Neovascularization

ZHENG Sheng-wu，HUANG Xiong-mei，ZHUANG Jing，LIN Gen-hui，YANG Yu，DING Xin

[Fujian Medical University Provincial College of Clinical Medicine（Department of Plastic Surgery，Fujian Provincial Hospital）Fuzhou 350001，Fujian，China]

Abstract： Objective To investigate whether desferrioxamine （DFO） can improve the homing of endothelial progenitor cells （EPCs）and improve neovascularization in ischemic hindlimb of rats. The relevant mechanism was also explored. Methods EPCs of luciferase transgenic Lewis rats were isolated and cultured as transplantation cells. Experimental animal NOD/SCID nude mice were randomly divided into five groups of 10： control， EPCs， EPCs-DFO， EPCs-DFO-AMD （AMD3100， CXCR4 inhibitor）， and EPCs-DFO-LY（LY294002， the PI3K inhibitor） groups. Left hindlimb ischemia was induced by ligating the left femoral artery in nude mice. EPCs were transplanted via the left femoral artery. After cell transplantation， intraperitoneal injection of DFO（100mg/kg/d）， DFO and AMD3100（10mg/kg/d）， DFO and LY294002（20mg/kg/d），were performed respectively to different groups for 14 days. The experimental results were evaluated from three aspects： histology， molecular biology and cytology. Results DFO treatment increased the perfusion of ischemic hindlimb and improved the function of ischemic hindlimb in nude mice. The number of new capillaries was significantly higher than that of other groups. Moreover， VEGF， p-eNOS and p-AKT were significantly increased through Western Blotdetection. In bioluminescence imaging， DFO significantly increased the migration of EPCs to ischemic limbs. All these effects were diminished by LY294002. Conclusion DFO treatment increased the migration of EPCs to ischemic limbs， improved blood perfusion and hindlimb function in ischemic limbs， up-regulated the secretion of pro-angiogenic factors and promoted neovascularization of ischemic tissue. These effects are mediated by the PI3K/AKT signal transduction pathway.

Key words： hypoxia mimetic agent； HIF-1； EPCs； homing； neovascularization； PI3K/AKT signaling pathway

血管新生过程在缺血性疾病中起重要作用，大量的动物实验证明移植EPCs可以改善缺血组织的血管新生过程[1]。但是最近研究表明外源性EPCs移植后向损伤处的迁移和停留数量较低[2]，这表明单纯性的移植EPCs对缺血组织的治疗作用不充分。2004年Ceradini发现祖细胞向损伤处的招募是通过HIF-1（Hypoxia Inducible Factor-1，低氧诱导因子1）诱导的SDF-1（Stromal Cell Derived Factor-1，基质细胞衍生因子1）表达，受氧梯度调节[3]。缺氧环境是重要的刺激因素，可以激活HIF-1α，调节下游的SDF-1和VEGF的表达[4-5]，从而进一步调节细胞功能和组织对缺氧环境的回应。SDF-1和受体CXCR4被证明可以促进EPCs招募、增殖，并且调节干细胞的迁移，加速缺血组织的血管化过程[3，6]。

铁螯合剂DFO用于治疗铁过量等疾病，可以抑制脯氨酰羟化酶的活性，从而稳定HIF-1α的表达[7]，在实验中常作为低氧模拟剂。最近的动物实验研究表明DFO可以加速缺血组织的血管化[8-9]。本实验应用DFO模拟组织缺氧环境，研究DFO是否可以促进EPCs向缺血缺氧区域的迁移归巢，从而促进缺血组织的血管化，同时研究该过程的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器：3周龄荧光素酶转基因Lewis雄性大鼠5只，由日本Jichi医学院提供。8周龄雄性NOD/SCID裸鼠50只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。淋巴细胞分离液（Sigma-Aldrich，美国），Mouse Anti-CD34（Santa Cruze，美国），Rabbit Anti-CD133（Abcam，美国），Mouse Anti-CD31（Dako，美国），Mouse Anti-KDR（Abcam，美国），Goat Anti-rabbit 488（Invitrogen，美国），Goat Anti-mouse 488（Invitrogen，美国），Goat Anti-rabbit 555（Invitrogen，美国），Goat Anti-mouse555（Invitrogen，美国），Rabbit Anti-α-SMA（Abcam，美国），Rabbit Anti-Luciferase（Abcam，美国），荧光素酶底物（Promega，美国），CO2培养箱（Beckman，美国），流式细胞仪（BD，德国），恒倒置相差显微镜（Nikon，日本），荧光显微镜（Nikon，日本），IVIS Imaging System（Xenogen，美国），激光散斑成像（Moor Instrument，英国）。

1.2 细胞分离、培养及鉴定

1.2.1 EPCs的分离与培养：3周龄雄性luciferase转基因Lewis大鼠，用10%水合氯醛过量麻醉处死。分离出股骨、胫骨和肱骨，用冷PBS冲出骨髓，然后用PBS将细胞洗涤3次。15ml离心管底部加入3ml淋巴细胞分离液，上层加入骨髓细胞混悬液，用密度梯度离心法分离细胞，PBS洗涤3次。在收集的单个核细胞中加入CD34单克隆抗体10μl， 混匀后4℃孵育30min；工作液（PBS+5%胎牛血清）重悬，1 500r/min离心5min，共离心2次；收集细胞，加入100μl工作液，加入磁珠二抗10μl，摇匀后4℃孵育30min；通过MACS磁性分离柱，获取CD34+细胞；EGM-2MV重悬，调整细胞浓度至107/ml，接种于直径10cm的培养皿内，37℃、5% CO2培养箱内培养；原代细胞3d换液，去除未贴壁的细胞，待细胞长满后传代培养。

1.2.2 摄取DiI-Ac-LDL（荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白）试验：将分离培养3d的CD34+细胞接种于盖玻片上；细胞爬片约有60%融合率时取出爬片，PBS漂洗5min，共3次；加入10μg/ml的DiI-Ac-LDL，37℃避光孵育3h；荧光显微镜观察，计数染色阳性的细胞比例。

1.2.3 流式分析细胞表面标记物变化：将细胞（2×105）与稀释的抗体混合，包括CD34（1：100），CD133（1：200）和KDR（1：200）抗体，置于4℃，孵化30min；以1 500r/min离心5min，清洗2次，弃上清，PBS重悬；加入二抗孵化30min，稀释比例1：500，PBS重悬，以1 500r/min离心5min，清洗2次；流式细胞仪检测，并用FCS Express 4软件分析结果。

1.3 动物模型制备、细胞移植及实验分组

1.3.1 动物模型制备：裸鼠下肢缺血手术模型参考以前的报道制备[10]。

1.3.2 EPCs移植：将裸鼠按体重以0.5mg/g戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉；在左大腿中间处纵行切开皮肤，暴露并分离股动、静脉，在股动脉的近端用10-0的尼龙线结扎；用带有29G针头的1ml注射器从股动脉近端刺入，将2×105（总量200μl）个细胞通过股动脉注射进入全身循环；迅速用10-0尼龙线结扎股动脉的远端，剔除此段股动脉；7-0尼龙线缝合皮肤，将裸鼠放回笼内饲养。

1.3.3 实验分组：将实验动物随机分成5组，每组10只，观察14d：①对照组：PBS组；②EPCs组：移植2×105个EPCs；③EPCs-DFO组：移植2×105个EPCs，术后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d；④EPCs-DFO-AMD组：移植2×105个EPCs，术后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，AMD3100 10mg/kg/d；⑤EPCs-DFO-LY组：移植2×105个EPCs，術后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，LY294002 20mg/kg/d。

1.4 下肢状态评价：将缺血下肢分为完全成活，足部坏死和下肢截肢3种，分别统计各组中3种类型的数量，并进行统计学分析。

1.5 激光散斑血流成像仪检测下肢血流灌注：FLPI（Full-Field Laser Perfusion Imager激光散斑成像）装置放于温和（24℃）及安静的环境中，CCD照相机放置在高于待测组织表面25cm处，相机曝光时间设置为20ms，保证每次检查时设置一致。分别检测术后当日，第3、7和14天观察缺血下肢血流灌注情况。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠，静置10min，待呼吸平稳后，用激光散斑血流成像仪进行下肢血流检测，观察下肢的血流灌注范围及强度。通过MoorFLPI 2.0记录图像，红色表示血流较强区域，蓝色表示血流较少的区域。用该软件进行数据分析，为了去除测量的偏倚，计算下肢灌注血流比值。灌注血流比值=患肢血流/正常下肢血流。

1.6 生物發光成像技术：为了检测移植细胞在体内的分布情况，分别在术后即时、3d、7d和14d进行检测。每只裸鼠腹腔注射D-Luciferin（150mg/kg），10min后将裸鼠置于麻醉箱内，2.5%的异氟烷吸入麻醉，将麻醉好的裸鼠置于成像的CCD暗室中，成像2min。通过Caliper Life Sciences分析数据，在生物发光获得的图片中，红色代表光子信号最强，蓝色代表光子信号最弱，以未注射细胞的裸鼠成像后得到的数值作为基线，超过基线的为有效数据，低于基线的为背景值。

1.7 免疫荧光染色：术后第14天颈椎脱位处死裸鼠，取下缺血下肢的大腿肌肉，OCT包埋组织，制备7μm冰冻切片进行免疫组化分析；0.1% BSA 1：50稀释一抗抗体：CD31、α-SMA、CXCR4和兔抗荧光素酶，4℃孵化过夜；滴加荧光二抗Goat Anti-Mouse或Goat Anti-Rabbit，1：500稀释，37℃放置1h，PBS摇床晃洗3次，每次15min；DAPI 1：1 000稀释滴加于切片上，染色5s，PBS清洗5min，共3次，荧光封片剂封片，-20℃保存；荧光显微镜拍照，Image-Pro plus 6.0分析图像。

1.8 Western Blot检测组织中细胞因子：从缺血下肢内收肌中提取的总蛋白用10% SDS-PAGE电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上，将膜放在PBS中漂洗1次，浸入0.5% BSA封闭，室温封闭1h以上。将一抗用0.5% BSA稀释：p-AKT（1：500）， AKT（1：500）， VEGF（1：1 000），SDF-1（1：1 000）， HIF-1（1：500）， p-eNOS（1：500）， eNOS（1：500）， GAPDH （1：1 000），将膜浸入其中，4℃过夜。洗膜，用0.5% BSA 1：500稀释二抗，室温孵育1h。洗膜，把膜与Super Signal Western blotting化学发光底物在室温下孵育5min，暗室内曝光X光片，然后显影定影。

1.9 统计学分析：使用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差的形式表示。当方差齐时，两两比较采用LSD-t检验，组间（n>2）比较采用单因素方差分析；方差不齐时，两两比较采用Mann-Whitney U检验，多重检验校正采用Bonferroni校正。以α=0.05为检验水准，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转基因大鼠骨髓来源的EPCs形态及鉴定：分选后的细胞贴壁生长早期细胞多为长梭形，贴壁后生长迅速，呈克隆样生长；至8～9d，细胞的形态由梭形变成多角形并融合成片状，形成类似成熟血管内皮细胞形态，呈典型的“铺路石”样外观。细胞表现了较强的摄取DiI-Ac-LDL能力，荧光显微镜下观察DiI-Ac-LDL荧光染色占贴壁细胞的（88.75±1.2）% 。应用流式细胞分析进行细胞表型的鉴定，CD34阳性率为（64.95±4.06）%，CD133阳性率为（90.5±2.27）%，KDR阳性率为（30.79±1.93）%。结果表明培养得到的细胞为EPCs。

2.2 DFO促进缺血下肢再血管化

2.2.1 下肢状态评价：术后第14天观察缺血下肢状态，EPCs-DFO组有6.7%的裸鼠缺血下肢发生截肢，足部坏死发生率为33.3%，60%的裸鼠缺血下肢完好，明显高于其他组。在EPCs-DFO-LY组下肢发生截肢的比例最高，为73.8%。该结果表明DFO的应用显著减少了下肢坏死的发生几率，该作用可被LY294002抑制。见图1。

2.2.2 下肢血流灌注检测：术后第14天血流灌注率分别为：对照组（39.39±0.03）%、EPCs组（60.67±0.03）%、EPCs-DFO组（80.63±0.03）%、EPCs-DFO-AMD组（65.89±0.05）%、EPCs-DFO-LY组（34.49±0.05）%。EPCs-DFO 组缺血下肢的血流在术后第14天明显高于其他组，缺血下肢血流恢复明显。EPCs-DFO-AMD组和EPCs组术后第14天血流灌注情况明显好于对照组和EPCs-DFO-LY组。结果表明DFO改善了缺血下肢的血流灌注情况，该作用被LY294002抑制。见图2。

2.2.3 血管密度计数：CD31特异性染色标记小血管和微血管，α-SMA特异性染色标记动脉。在EPCs-DFO组毛细血管密度计数和动脉密度计数明显高于其他组，EPCs-DFO-AMD和EPCs组的血管密度计数也明显高于对照组，而LY294002抑制血管新生。见图3。

2.3 DFO对外源性EPCs的影响

2.3.1 生物发光成像检测EPCs在体内的分布：带有luciferase标记的EPCs通过股动脉注射移植入裸鼠体内，移植的细胞早期聚集于裸鼠的肺部以及缺血下肢，在随后的3d中肺内的信号逐渐下降至消失。术后14d，EPCs-DFO组缺血下肢的光子信号强度明显高于其他组，表明较多的细胞聚集于此，这种作用被AMD3100和LY294002所抑制。见图4。

2.3.2 外源性EPCs在缺血下肢的分化以及CXCR4的表达：免疫荧光染色观察到移植的外源性EPCs分化成血管内皮细胞参与了组织的修复。进一步观察术后14d组织切片CXCR4的表达，EPCs-DFO的CXCR4表达明显高于其他组，该作用被LY294002所抑制。这些结果表明DFO促进EPCs向损伤处的迁移，通过自身分化促进血管生成。见图5。

2.4 Western Blot检测组织中细胞因子：在DFO的刺激下观察缺血组织中各种蛋白的表达，EPCs-DFO组HIF-1α较其他组表达更高，其下游的p-AKT，VEGF，SDF-1和p-eNOS也出现高表达，EPCs组和EPCs-DFO-AMD组蛋白的表达情况相似，高于对照组，LY294002抑制这些蛋白的表达。结果表明DFO刺激促血管生成因子的表达，这种作用被PI3K抑制劑LY294002所抑制。见图6。

3 讨论

EPCs在血管化过程中起重要作用，尤其在缺血环境中。EPCs移植发挥作用主要通过EPCs向缺血或创伤组织迁徙，分泌一类促进血管新生的因子和直接分化为血管内皮细胞参与新的血管生成而发挥治疗作用[11-12]。因此，EPCs向缺血或创伤部位的靶向归巢是其发挥作用的重要前提。

目前干细胞归巢的机制仍不能完全明确，主要的分子机制包括：SDF-1/CXCR4信号轴、HGF/c-met信号轴、MCP-3/CCR1、3、5信号轴以及黏附因子等[13]，其中SDF-1/CXCR4信号轴通路是目前研究最多的一种机制。SDF-1被认为是重要的趋化因子，招募干细胞向损伤处迁移。SDF-1/CXCR4的激活可以上调EPCs向缺血损伤处的迁移，进一步促进血管化[14]，可以通过提高靶组织SDF-1的含量和/或上调CXCR4的表达[15]，来促进干细胞归巢。研究表明缺氧环境可以通过激活SDF-1，增加EPCs的迁移，刺激缺血组织血管化[3]。DFO通过稳定HIF-1α蛋白模拟缺氧环境，激活SDF-1及下游基因表达[16]。因此DFO可能成为一种新的方法促进EPCs归巢。

在本实验中，笔者证实了DFO的应用显著减少了下肢坏死的几率，改善了缺血下肢的血流灌注情况，增加了缺血组织的毛细血管密度和动脉密度，结果证明了DFO可以促进缺血下肢再血管化。通过移植带有荧光素酶报告基因的EPCs，应用生物发光成像技术动态观察细胞的迁移，发现移植的外源性EPCs向损伤处迁移。在移植早期，细胞主要分布在肺内及向损伤处聚集。术后14d，DFO组缺血下肢的光子信号强度明显高于其他组，表明较多的EPCs聚集于此，结果证明DFO的应用促进了EPCs向损伤缺血组织的靶向归巢。通过免疫荧光染色观察到移植的外源性EPCs分化成血管内皮细胞，参与了组织的修复，并且DFO组的CXCR4表达明显高于其他组。通过WB检测发现DFO组的各种促血管生成因子的表达高于其他组。因此，应用DFO是一种有效地促进EPCs向损伤处迁移、靶向归巢的策略。

在多种类型的细胞研究中发现 PI3K/AKT信号转导通路在细胞增殖、迁移和存活方面中起重要作用。Zheng[17]报道PI3K/AKT/eNOS信号转导通路在SDF-1诱导的EPCs迁移中起调控作用，Jiang[18]报道PI3K信号可以调控VEGF的表达，Dimmeler[19]报道PI3K信号在血管化过程中激活eNOS。因此，PI3K/AKT通路可能与血管化过程相关。在本实验中，DFO促进血管化和EPCs靶向归巢的作用以及促进SDF-1、CXCR4、p-AKT、p-eNOS高表达的作用均能够被PI3K/AKT抑制剂LY294002和CXCR4拮抗剂AMD3100所废除或部分抑制。AMD3100虽然是CXCR4受体的拮抗剂，但是被证明可以促进血管新生过程，抑制血管生成过程[20]，本文的实验结果与文献报道相符。LY294002作为PI3K抑制剂，能够废除DFO促进EPCs靶向归巢和血管新生的作用，表明DFO对EPCs迁移的影响与PI3K/AKT信号转导通路相关，实验结果与Peyvandi[21]的报道相符。

总之，DFO作为低氧模拟剂，是用于治疗缺血性疾病的一种有潜力的药物，其作用机制是通过稳定HIF-1α的表达，模拟低氧环境，激活PI3K/AKT信号通路，上调下游SDF-1、VEGF等因子的表达，促进EPCs的归巢，提高缺血组织血管化，改善缺血组织血流灌注。

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[收稿日期]2018-10-19 [修回日期]2018-11-11

編辑/贾敏