马铃薯淀粉渣固态培养产朊假丝酵母的培养基优化研究

张靓 刘香莹 权桂芝 童应凯 张怡

摘  要：利用马铃薯废渣为主要原料，固体培养产朊假丝酵母菌。通过单因素实验确定其最优加水量为100%与接种量为10%，设计并实施了葡萄糖、硫酸铵、水、磷酸二氢钾、硫酸镁五因素四水平的正交实验，发酵后测定菌数，确定了最佳的培养基配方：葡萄糖9%、磷酸二氢钾0.1%、水与物料1：1，在此配方下，接种量10%，30℃培养48h，菌量最高可达6.63亿个/g。

关键词：马铃薯;淀粉渣;固体发酵;产朊假丝酵母

中图分类号：S532              文献标识码：A    DOI：10.11974/nyyjs.20181233001

中国是马铃薯生产大国，生产总量位居世界第一。近年来，由于我国淀粉加工业的飞速发展，马铃薯废渣作为副产物，产量巨大。如果不能及时合理地处理掉，就会造成资源的浪费和环境的污染，是世界各国相关生产企业和环境保护机构有待解决的重要问题。产朊假丝酵母（Candida utilis）是优良的生物饲料生产菌种，在饲料行业得到广泛应用。本研究试图以马铃薯淀粉废渣为产朊假丝酵母培养料，进行固体发酵生产生物饲料，不仅能够缓解蛋白原料短缺的现状，还可以降低环境污染，变废为宝。

1     材料与方法

1.1     材料

1.1.1     菌種

产朊假丝酵母（Candida utilis）是天津农学院微生物实验室保藏菌种。

1.1.2     培养基

种子液培养基。

YEPD培养基（g）：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，115℃湿热灭菌20min。

发酵培养基。

基本固体培养基（%）：马铃薯废渣60%、麸皮40%，水，121℃，20min。

1.1.3     主要仪器

8037-SGS超型自动压力蒸气灭菌器，T-500型电子天平，mA200电子天平，100～1000?l和10～100?l的微量移液器，恒温培养振荡器，电热恒温培养箱，生物显微镜，血球计数板，漩涡震荡器。

1.2     试验方法

1.2.1     斜面活化

将实验室冰箱中保藏的菌种接种在斜面培养基上活化，30℃，培养48h。

1.2.2     种子培养

从斜面适量菌种到装量为60mL/250mL三角瓶中，30℃，180r/min，培养20h。

1.2.3     发酵培养

以1mL接种量接入与种子培养基相同的培养基中，装入250mL三角瓶内，30℃，培养48h。

1.2.4     单因素试验

为寻求产朊假丝酵母培养基中各组分对菌数影响的因素，从以下几个方面进行试验：从接种量与含水量确定固态发酵配方对菌数产生影响的最佳浓度，每个水平因素共有4个水平，每个水平有3个重复试验（见表1）。

1.2.5     正交试验

为了提高产朊假丝酵母的生长数量，培养基优化采用五因素四水平L16（45）正交试验，共设有16个处理，每个处理有3个重复试验。麸皮、马铃薯废渣两种简单有机碳源发酵实验。根 据单因素试验的结果，选择葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、水与固料的比值做正交试验。用250mL三角瓶装固料10g包括麸皮4g，马铃薯废渣6g，水10mL，搅拌均匀，用微量移液器加人1mL的产朊假丝酵母菌液，在30℃恒温箱中进行48h发酵，利用血球计数板法观察并记录，最后筛选出优化组合。（见表2）。

1.2.6     产朊假丝酵母固体发酵正交实验设计（见表3）

按正交实验表配以底料10g（马铃薯废渣6g，麸皮4g）的培养基，加入不同比例的微量元素，并做3组重复。为使产朊假丝酵母菌能均匀分布到培养基中，可将产朊假丝酵母摇匀，然后向上述培养基中使用微量移液器加入1mL菌液。

接种好后把各组实验放入30℃恒温箱培养，48h后取出血球计数板法观察记录产朊假丝酵母菌数。观察产朊假丝酵母数量方法如下：搅拌均匀，从三角瓶中取出1g样品，加入由离心管装的10mL无菌水中，使用漩涡震荡器将样品充分混匀后，使附着于固体样品表面的菌均匀稳定分布在无菌水内。再吸取1mL混匀菌液，加入9mL无菌水内稀释，加入100?l的美蓝染色液，摇匀。将菌液放到血球计数板上，用40倍显微镜观察，运用血球计数板（25×16）数菌数的方法，通过计算，便可得出菌种数量。

1.2.7     最佳配方重复

产朊假丝酵母菌的数量测定后，用极差分析出最佳结果，选出最佳培养基。重复最佳添加剂配方试验，进行培养并测定菌数。

2     结果与分析

2.1     产朊假丝酵母发酵条件的单因素试验

2.1.1     不同接种量对菌数的影响

据有关文献报道，接种量对产朊假丝酵母菌数影响较大。选择上述优化的培养基9%的葡萄糖为碳源，0.1%的磷酸二氢钾（其余成分同发酵培养基），选择接种量在4 %～12%之间，数据（3次重复实验平均值）结果表明菌数随着接种量的增加而增大，接种量从4%增加到16%时，菌数从2.25亿个/g增加到4亿个/g，提高了56.3%。当接种量为16%时，其菌数表现出最高水平，为4亿个/g（见图1）。但由于10%～16%的趋势平缓，且成本增高的原因，通过进一步进行试验，确定10%的接种量在实际生产中的性价比与产值最优，故最优接种量为10%。

2.1.2     不同含水量对菌数的影响

在测试含水量的影响时，为了减少不同水份的湿重/干重的误差，均计算为干重下菌数。用固料与加水量1：1、1：1.3、1：1.6、1：1.9的比例来配培养基，使之达到不同的含水量，选择上述优化的培养基9%的葡萄糖为碳源，0.1%的磷酸二氢钾，其余成分同发酵培养基，数据（3次重复实验平均值）结果表明在含水量80%～200%之间，含水量对菌数有一定的影响。在含水量120%时，菌数最高为3.51亿个/g，在200%时，菌数最低为2.43亿个/g，变化幅度为30.8%（见图1）。因此，进一步试验选择含水量为100%。

2.1.3     单因素试验小结

通过产朊假丝酵母培养的单因素试验，得到菌种在葡萄糖9%，磷酸二氢钾0.1%，pH6.0（其余成分同发酵培养基）接种量12 %，固料底物与加水量比值为1：1，30℃在培养箱发酵48h的培养条件下，其菌数可达到4亿个/g。

2.2     正交试验结果及极差分析

根据L16（45）正交试验表，每一个处理均有3个重复试验，结果及极差分析见表3。

2.3     正交试验小结

从表3的分析中可知，葡萄糖（碳源）为主要的影响因素，葡萄糖浓度的变化对产朊假丝酵母菌数影响最大，最适的葡萄糖浓度为9%;磷酸二氢钾浓度的变化对产朊假丝酵母菌数的影响次于葡萄糖的作用，以0.1%磷酸二氢钾浓度最好;硫酸铵及硫酸镁浓度的变化对产朊假丝酵母菌数的影响不是很大。可能原因是麸皮和马铃薯废渣中本身就含有这两种微量元素。而磷酸二氢钾与葡萄糖则需补充。

3     结论

单因素实验测定出产朊假丝酵母发酵最佳培養条件的加水量是100%，接种量是12%。通过正交试验的优化组合，得到产朊假丝酵母菌数的最优培养条件是：葡萄糖9%，磷酸二氢钾0.1%，水与固料比值为1：1，初始pH值6.0，接种量12%，加入10mL蒸馏水，以10g马铃薯废渣与麸皮混合的培养基为固体底料，加入1mL产朊假丝酵母菌液，发酵温度为30℃，培养48h，在此优化的培养条件下，产朊假丝酵母的菌数可达6.63亿个/g。通过接种酵母菌进行固体发酵，转化为生物饲料，可以有助于解决马铃薯淀粉废渣的污染问题，变废为宝。

参考文献

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