兔源产ESBLs大肠杆菌耐药性与优势基因型研究

坤清芳，耿 毅，余泽辉，汪开毓，李亚军，牟维豪，邓钊宾，张雨薇

(1四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130;2阿坝州中等职业技术学校，四川 茂县 623200)

β-内酰胺类药物是医学临床抗感染治疗中使用最广的抗生素之一，在兽医临床上也发挥着极其重要的作用，但随着药物的广泛使用，细菌耐药现象日益严重。目前，细菌对该类药物耐药的一个重要机制是产生超广谱 β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)，ESBLs多数是由质粒介导的能水解氧亚氨基β-内酰胺类药物的一类水解酶，伴随着β-内酰胺类药物的广泛应用以及不合理的使用，产ESBLs的菌株也变得越来越常见，并在选择和进化压力下产生多种不同的ESBLs基因型和基因亚型菌株[1]。编码ESBLs的基因还往往与其他耐药基因共存于同一质粒中，导致细菌产生多重耐药性[2]。产ESBLs的菌株可通过动物饲养、肉制品加工及食用过程传递给人，目前国外已有关于产ESBLs菌株引起疾病暴发流行的报道[3]。ESBLs 型别众多，其中主要流行TEM型、SHV型、CTX-M型和OXA型ESBLs。

TEM-ESBLs来源于TEM-1和TEM-2基因序列发生突变造成1～5个氨基酸改变而形成的一系列酶，目前已发现200多种亚型；SHV-ESBLs主要来自肺炎克雷伯菌，该类型酶对头孢噻吩的巯基具有水解作用； CTX-M-ESBLs属于一类很特别的A类活性位点丝氨酸β-内酰胺酶，近年来CTX-M-ESBLs在全球范围内快速传播，已经替代TEM型和SHV 型成为全球最流行的ESBLs；OXA-ESBLs 是近年来数量迅速增加的一类ESBLs，多数是由OXA-1、OXA-2和OXA-10基因序列发生突变造成1个或数个氨基酸改变而形成的一系列酶，目前已发现100多种亚型。ESBLs不仅型别众多，且不同国家或地区流行的基因型和基因亚型都存在差异。大肠杆菌既是临床产ESBLs的代表性菌属，又是重要的人畜致病菌，因此国内外对产ESBLs大肠杆菌开展了大量研究，目前已有鸡源、鸭源、猪源和牛羊源产ESBLs大肠杆菌的相关研究报道[4-6]，而有关兔源产ESBLs大肠杆菌的研究却鲜有报道。本研究以四川省兔源大肠杆菌为研究对象，对其产 ESBLs大肠杆菌耐药性及优势基因型进行研究，以初步了解四川地区产ESBLs大肠杆菌菌株的耐药情况,及ESBLs的优势基因型和基因亚型，为指导临床合理使用抗菌药物，以及进一步探讨大肠杆菌ESBLs耐药基因的进化机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 2014-2015年，从四川省雅安、自贡、绵阳、德阳和成都等地区不同家兔养殖场分离鉴定出大肠杆菌共97株，其中雅安20株、自贡26株、绵阳11株、德阳15株、成都25株，菌株均由四川农业大学动物医学院病理室保存；大肠埃希菌 ATCC25922购自中国普通微生物菌种保存中心。

1.1.2 主要试剂 MH培养基和LB肉汤培养基，购自北京奥博星生物有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×startTaqMix、细菌质粒小提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；DNA Marker DL2000 、琼脂糖，购自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 产ESBLs菌株筛选 表型检测采用CLSI推荐的双纸片法[7]进行操作和判读。初筛试验：将受试菌均匀涂布于 MH 琼脂平板，贴头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)药敏纸片，37 ℃培养16 h，观测抑菌圈直径,满足CAZ抑菌圈直径≤22 mm 或CTX抑菌圈直径≤27 mm的菌株可能为产ESBLs 菌株。确证试验：将受试菌均匀涂布于 MH 琼脂平板，贴头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/Clav)和头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/Clav)2组药敏纸片，37 ℃培养16 h，若任一组药物的抑菌圈直径差≥5 mm，则可判定相应菌株为产ESBLs菌株。

1.2.2 药敏试验 采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验。将97株大肠杆菌接种于LB肉汤培养基，37 ℃振荡培养18 h，麦氏比浊法调整菌液细菌含量为1.0×108CFU/mL，将菌液均匀涂布于MH琼脂平板，贴药敏纸片，37 ℃培养16～18 h，参照CLSI[7]的标准进行结果判断。数据统计时，将中介菌株直接归于耐药菌株。

1.2.3 ESBLs基因型和基因亚型的检测 采用PCR反应检测ESBLs的基因型和基因亚型，参照文献[8-10]设计引物(表1)，交由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。使用细菌质粒小提试剂盒提取产ESBLs菌株DNA模板。PCR反应体系为25 μL：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×TapPCR Master Mix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。TEM、SHV、OXA基因PCR程序：94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;72 ℃延伸 7 min。CTX-M基因PCR程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸 7 min。CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9基因组PCR程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，52 ℃/55 ℃/50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸7 min。反应结束后取5 μL扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并将阳性产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，将获得的基因序列用NCBI中的Blast、DNA Star软件和 MEGA5.1 软件进行序列对比分析，确定基因型和基因亚型。

表1 ESBLs基因的引物序列Table 1 Primers sequences of ESBLs genes

2 结果与分析

2.1 ESBLs检测结果

97株兔源大肠杆菌在初筛试验中，有76株为疑似产ESBLs菌；经确证试验，76株疑似菌株中有69株被确认为产ESBLs菌，占总菌株数的71.13%(69/97)，非产ESBLs菌有28株，占总菌株数的28.87%(28/97)。

2.2 产ESBLs和非产ESBLs菌株耐药情况比较

产ESBLs和非产ESBLs兔源大肠杆菌菌株的耐药性比较见表2。

表2 产ESBLs和非产ESBLs兔源大肠杆菌菌株的耐药性比较Table 2 Comparison of drug-resistance between producing and non-producing ESBLs Escherichia coli strains isolated from rabbits

注：同行数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each row indicate significant difference (P<0.05).

由表2可知，产ESBLs菌对12种药物的耐药率均高于非产ESBLs菌株，其中头孢西丁、头孢唑啉、头孢他啶、阿米卡星和诺氟沙星的耐药率显著高于非产ESBLs菌(P<0.05)。产ESBLs菌多重耐药率极显著高于非产ESBLs菌，其多重耐药率分别为100%(69/69)和85.71%(24/28)。

2.3 ESBLs基因型和基因亚型的检测

2.3.1 基因型检测 对产ESBLs菌的基因型进行检测，结果表明，未检出SHV基因；TEM、CTX-M和OXA基因片段大小分别为861,593和564 bp，与预期结果一致(图1)。将PCR产物测序结果在NCBI上进行Blast比对，TEM阳性产物序列与GenBank上收录的基因(登录号：KT956435.1)相似性介于99%～100%，CTX-M阳性产物序列与GenBank上收录的基因(登录号：LC091534.1)相似性介于99%～100%，OXA阳性产物序列与GenBank上收录的基因(登录号：KR780477.1)相似性介于99%～100%，表明所扩增的片段为对应的基因。由表3可知，69株产ESBLs菌中检出TEM基因型43株(占62.32%)、CTX-M基因型44株(占63.77%)和OXA基因型16株(占23.19%)；在69株产ESBLs菌中，44.93%的菌株只携带1个ESBLs基因，55.07%的菌株携带2个或2个以上的ESBLs基因。

表3 69株产ESBLs兔源大肠杆菌菌株基因型检出情况Table 3 Detection of genotypes of 69 ESBLs-producing Escherichia coli strains isolated from rabbits

M.DNA Marker；+.阳性对照；-.阴性对照；1～6.分离株M.DNA Marker;+.Positive control;-.Negative control;1-6.Isolated strains

2.3.2 基因亚型检测TEM亚型：将43株TEM型阳性菌株进行测序，菌株分属于TEM-57(1株)、TEM-116(2株)和TEM-1(40株)等3种基因亚型，检出率分别为2.33%，4.65%和93.02%。

CTX-M亚型：对44株CTX-M型阳性菌株进行基因亚型组检测，检测到CTX-M-1组阳性菌株9株和CTX-M-9组阳性菌株36株，检出率分别为20.45%和81.82%，其中1株分离菌同时为CTX-M-1组和CTX-M-9组阳性菌株，未检测到CTX-M-2组阳性菌株。CTX-M-1亚型组中较流行的基因亚型包括CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-3、CTX-M-15和CTX-M-55等;CTX-M-9亚型组中较流行的基因亚型包括CTX-M-9、CTX-M-14、CTX-M-17、CTX-M-24、CTX-M-27和CTX-M-65等。本研究中，CTX-M-1组阳性菌株分属于CTX-M-15 (1株)和CTX-M-55 (8株) 2种基因亚型，检出率分别为2.27%和18.18%；CTX-M-9组阳性菌株分属于CTX-M-17(1株)、CTX-M-65(6株)和CTX-M-14(29株) 3种基因亚型，检出率分别为2.27%，13.64%和65.91%。

OXA亚型：将16株OXA型阳性菌株进行测序，菌株分属于OXA-10(1株)和OXA-1(15株) 2种基因亚型，检出率分别为6.25%和93.75%。

综上可知，产ESBLs大肠杆菌菌株分属于TEM-57、TEM-116、TEM-1、CTX-M-15、CTX-M-55、CTX-M-17、CTX-M-65、CTX-M-14、OXA-10、OXA-1等10个基因亚型，其中TEM-1 亚型、CTX-M-14亚型和OXA-1亚型分别是各基因型的优势基因亚型。

3 讨 论

自1983年德国首次发现产ESBLs菌株以来，世界各地产ESBLs菌株的检出率呈现逐年上升趋势，分布范围不断扩大，尤其值得注意的是编码这些酶的基因不仅可通过接合、转化以及转导等方式在细菌间快速扩散，还常常与其他非ESBLs酶耐药基因整合于同一质粒，导致多种耐药基因同时随质粒广泛传播，给临床治疗带来困难，因此开展ESBLs监测对指导临床有效用药是非常必要的[11-13]。本研究采用CLSI推荐的标准方法对分离自四川省各地区97株兔源大肠杆菌进行ESBLs表型检测，检出率为71.13%，该结果高于西藏地区鸡源大肠杆菌的检出率25%[14]，广东省食品动物源大肠杆菌的检出率19.37%[15]，四川省畜禽源大肠杆菌的检出率36.83%[5]，而低于青岛地区鸡源大肠杆菌的检出率83.13%[3]的检测结果，说明不同来源、不同地区的产ESBLs菌株流行分布存在差异，且此次较高的检出率提示产ESBLs菌株在四川地区家兔养殖场中普遍流行。刘保光等[16]发现，产ESBLs菌株不仅对青霉素类、头孢菌素类药物表现出耐药性，而且还同时对多类药物表现出较高的交叉耐药性和多重耐药性；Yuan等[17]研究表明，80.6%的产 ESBLs 菌株表现多重耐药现象；曲志娜等[3]研究表明，产ESBLs菌株对多类药物的耐药率在80%以上，且产ESBLs 菌的多重耐药程度显著高于非产ESBLs 菌。本试验中产ESBLs菌株对12种药物的耐药率均高于非产ESBLs菌株，其中对头孢西丁、头孢唑啉、头孢他啶、阿米卡星和诺氟沙星的耐药率在产ESBLs菌和非产ESBLs菌中差异显著(P<0.05)；产ESBLs菌多重耐药程度显著高于非产ESBLs菌，该结果与上述研究结果一致，进一步证实了ESBLs基因可能会与其他非ESBLs酶基因整合，导致多药耐药的发生。

ESBLs基因型众多，其中主要流行的基因型有TEM、SHV、CTX-M和OXA。本试验中TEM、CTX-M和OXA型基因的检出率分别为62.32%(43/69)，63.77%(44/69)和23.19%(16/69)，未检测到SHV基因，该结果与国内其他动物源产ESBLs菌株基因型[3,5,15,17]基本一致，以TEM和CTX-M基因为主要流行基因型。此外，尽管OXA基因的检出率低于TEM和CTX-M基因的检出率，但该基因的检出说明四川地区兔源大肠杆菌中流行ESBLs基因的多样性。

TEM-1基因是目前革兰氏阴性菌中流行范围最广、检出率最高的TEM基因亚型。Paterson等[18]在调查意大利境内某医院22株产TEM-ESBLs大肠杆菌时发现，所有菌株携带的TEM基因亚型均为TEM-1亚型；Kiratisin等[19]报道，泰国境内产TEM-ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的基因亚型均为TEM-1亚型；Ahmed等[20]检测了日本广岛区零售鸡肉的69株大肠杆菌，发现产TEM- ESBLs菌株的基因亚型均为TEM-1亚型；苑丽等[21]检测河南地区鸡源大肠杆菌时发现，产TEM-ESBLs菌株的基因亚型均为TEM-1亚型；曲志娜等[3]研究表明，TEM-1亚型是青岛地区鸡源大肠杆菌携带的主要TEM基因亚型。本试验中TEM-1基因的检出率为93.02%(40/43)，表明TEM-1亚型是四川地区兔源大肠杆菌产TEM-ESBLs菌株携带的主要基因亚型。

CTX-M-ESBLs根据其氨基酸同源性分为6 个亚型组：CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25 和CTX-M-45[22]，其中CTX-M-1和CTX-M-9组是研究报道最多的酶类[23]。该类ESBLs在全球不同国家和地区之间呈现不同的流行趋势，且不同国家和地区流行亚型具有很大差异，即使同一国家的不同地区流行的亚型也复杂多变。据资料显示，法国和葡萄牙流行CTX-M-1亚型，西班牙流行CTX-M-14亚型，日本流行CTX-M-18亚型，而中国同时流行CTX-M-14、CTX-M-24、CTX-M-27和CTX-M-65[6]等亚型。本试验结果显示，基因亚型组CTX-M-1 组(20.45%，9/44)和CTX-M-9组(81.82%，36/44)同时流行于四川地区兔源大肠杆菌中，但以CTX-M-9 亚型组为主。苑丽等[21]报道，河南地区流行的基因亚型为CTX-M-14和CTX-M-65；曲志娜等[3]报道，青岛地区流行的基因亚型为CTX-M-65和CTX-M-55；佟盼盼[9]研究发现，东北三省和江苏省流行的基因亚型为CTX-M-15和CTX-M-55。本试验结果表明，四川地区最流行的CTX-M基因亚型为CTX-M-14亚型(65.91%，29/44)，其次为CTX-M-55亚型(18.18%，8/44)和CTX-M-65亚型(13.64%，6/44)，该结果与其他地区报道流行的CTX-M基因亚型不同，进一步说明CTX-M基因亚型的流行分布存在地区差异。

OXA-ESBLs 对头孢菌素的水解能力不一，其水解头孢菌素的能力低于水解青霉素类，是近年来数量迅速增加的一类 ESBLs。目前研究发现，国外人源大肠杆菌OXA基因亚型以OXA-2亚型和OXA-10亚型为主，国内则以OXA-1、OXA-2和OXA-10亚型为主[9]。苑丽等[24]报道，河南省鸡源大肠杆菌OXA-1亚型的检出率为22.45%；曲志娜等[3]报道，青岛地区鸡源大肠杆菌中OXA-1亚型的检出率高达47.83%；佟盼盼[9]研究发现，东三省和江苏省OXA型基因中以OXA-1亚型为主要基因亚型。本试验结果显示，OXA基因的检出率为23.19%(16/69)，其中OXA-1为主要的OXA基因亚型(93.75%，15/16)。

4 结 论

四川地区兔源产ESBLs大肠杆菌多重耐药性显著高于非产ESBLs大肠杆菌；TEM、CTX-M和OXA基因型的检出率分别为62.32%，63.77%和23.19%，未检测到SHV基因型，其中TEM和CTX-M基因型是产 ESBLs大肠杆菌中主要流行的ESBLs基因型，与国内其他地区流行的基因型一致，但基因亚型存在差异，TEM-1亚型、CTX-M-14亚型和OXA-1亚型分别是各基因型的优势基因亚型。

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