犬细粒棘球绦虫粪抗原间接夹心ELISA检测方法的建立

2018-02-26王永斌伏刚赵扬扬赖茂林陈千林曹政

四川畜牧兽医 2018年2期

王永斌，伏刚，赵扬扬，赖茂林，陈千林，曹政，3*

（1.重庆市巫溪县畜牧兽医局，重庆巫溪 405800；2.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆荣昌 402460；3.重庆市畜牧科学院，重庆荣昌 402460）

棘球蚴（包虫）病是由细粒棘球绦虫（Eg）中绦期所引起的一种世界性分布的人畜共患寄生虫病。犬是包虫病传播的重要传染源，因此，控制犬感染细粒棘球绦虫是防治包虫病的关键措施。本研究建立了诊断犬细粒棘球绦虫感染的双抗体夹心ELISA方法，该方法抗原制备简单、免疫原性强、制备量大，具有较好的特异性和敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 犬粪样品犬粪采自四川省石渠县、道孚县、炉霍县。

1.1.2 实验动物试验所用兔子、BALB/C小鼠均由重庆澳龙生物制品有限公司提供，并在其实验动物房开展相关试验。

1.2 方法

1.2.1 特异性表面抗原SMZ-OVA的制备将特异性表面抗原SMZ-OVA基因序列送至基因公司合成，上游插入EcoR I酶切位点，下游插入Sal I酶切位点，连接到pET-32a（+）表达载体。采用化学转化法[1]将质粒转化至Rosetta，使用氨苄青霉素（Amp）和氯霉素平板筛选阳性克隆，挑选阳性克隆子扩大培养，诱导并验证表达情况。

1.2.2 抗体制备首免用法国Seppic公司的ISA 15A VG佐剂将特异性表面抗原SMZ-OVA制成免疫抗原，以100 μg/mL浓度皮下注射4只实验兔（每只1 mL），同时将细粒棘球绦虫虫卵以300枚/mL皮下注射4只BALB/C小鼠（每只1mL）。21d和42d后，分别重复免疫一次。抗体效价达到要求后，收集全血，4000r/min离心10min，收集血清，置-70℃冻存。

1.2.3 抗体纯化取8 mL抗体，8 500 r/min离心30min；取上清，逐滴加入50%饱和度的硫酸铵溶液4 mL，边加边搅拌，4℃过夜；8 500 r/min，4℃离心3min；取上清，在磁力搅拌器上向烧杯中逐滴加入50%饱和度的硫酸铵溶液4 mL，4℃条件下过夜；8500r/min，4℃条件下离心30min，弃上清，将沉淀溶于3mL PBS缓冲液中，再倒入处理好的透析袋中，磁力搅拌，4℃条件下透析过夜；用移液器取出透析袋中的IgG，分装到1.5mL离心管中，-40℃条件下保存[2]。

1.3 间接夹心ELISA检测步骤用包被缓冲液将纯化的BALB/C小鼠腹水抗体稀释至8μg/mL，然后加入96孔酶标板中（100mL/孔），4℃放置过夜；弃去板孔中的溶液，加入稀释好的洗涤液（200 mL/孔），静置1min后倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤3次；加入封闭液（0.1%BSA+PBS，200 μL/孔），置 37℃下温育2h，弃去板孔中的溶液，加入稀释好的洗涤液（200μL/孔），静置1min后倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤3次；将1∶1稀释的待检样品、阴性对照样品和阳性对照样品各取100μL加至抗原包被板中，轻轻振匀，置37℃下温育30min，弃去板孔中的溶液，加入稀释好的洗涤液（200 μL/孔），静置 1 min 后倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤3次；每孔加兔血清稀释至30μg/mL，置37℃下温育30min，弃去板孔中的溶液，加入稀释好的洗涤液（200 μL/孔），静置1min后倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤3次；将山羊抗兔酶标二抗以1∶6 000比例稀释，按照100 μL/孔加入酶标板，置37℃下温育 30 min，弃去板孔中的溶液，加入稀释好的洗涤液（200mL/孔），静置1min后倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤3次；在每个反应孔中加入等体积的底物A液与底物B液（100 μL），避光显色10min，待显色结束后于每个反应孔中加入50μL终止液，10min内测定OD450nm值。

1.4 结果判定同时满足阳性对照OD450nm平均值≥0.60，阳性对照OD450nm平均值≥阴性对照OD450nm平均值×2.1，方可进行判定。

阳性判定：样品OD450nm值＞阴性对照OD450nm平均值×2.1。

阴性判定：样品OD450nm值≤阴性对照OD450nm平均值×2.1。

2 结果

2.1 犬粪细粒棘球绦虫卵阳性样品的制备先后收集了30只牧羊犬的粪便样品，运用饱和食盐水虫卵漂浮法[3]进行镜检，初步筛选阳性样品。镜检结果如表1所示。

表1 犬粪样品镜检结果

用饱和食盐水溶液漂浮虫卵时，分别在30min、60 min、90min、120 min、150 min、180min 参照麦克马斯特法计数[4]。30min时，虫卵上浮较慢（平均25个）；60 min时略有升高（平均30个）；90 min时，仍然没有漂浮完全（平均47个）；120 min时，虫卵的漂浮与富集均达到顶峰（平均60个）；150min时，虫卵开始下沉（平均54个）；180min时，虫卵个数基本保持不变，不再上浮和下沉（平均57个）。结果石渠县检出8份阳性样品，道孚县检出7份阳性样品，炉霍县检出7份阳性样品。

2.2 特异性抗原纯化特异性抗原纯化效果如图1所示。用镜检出的细粒棘球绦虫虫卵免疫BALB/C小鼠，用纯化出的特异性表面抗原免疫兔，分别收集小鼠腹水和兔高免血清，纯化高免抗体。

2.3 兔抗高免血清滴度检测结果见表2。

2.4 BALB/C小鼠腹水抗体含量测定结果见表3。根据计算结果取兔抗血清蛋白浓度为90000μg/mL。

2.5 间接夹心ELISA检测采用间接ELISA方法检测从四川省石渠县、道孚县、炉霍县等地采集的30份粪便样品，结果如表4、表5所示。

图1 特异性表面抗原SDS-PAGE图

2.6 镜检结果和间接夹心ELISA检测结果符合情况根据表5算出两种方法的阳性符合率为86.36%，总体符合率为90%。

3 小结

用饱和食盐水虫卵漂浮法检测出19个犬粪样品中含有细粒棘球绦虫虫卵，表明本次犬粪样品筛选较成功。用该法富集虫卵的最佳时间点是在静置120min时。犬细粒棘球绦虫粪抗原间接夹心ELISA方法的检测结果与漂浮虫卵法的镜检结果阳性符合率为86.36%，总体符合率为90%，说明该ELISA方法构建成功。本试验为后期研制犬细粒棘球绦虫粪抗原间接夹心ELISA检测试剂盒奠定了基础。

[1]郭全海，陈陆，王川庆，等.两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒[J].江苏农业科学，2010（5）：48-50.

[2]陈丹，孙广瑞，柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用[J].安徽农业科学，2007，35（26）：8105-8105.

[3]岳进巧，张彤，马秀敏，等.一种犬粪便中肠道寄生虫虫卵检查方法的建立[J].西部医学，2012，24（2）：221-223.

[4]余炉善，孙国清，时国军.三角锥瓶漂浮集卵法计数家畜线虫卵的试验报告[J].江西畜牧兽医杂志，1989（4）：10-11.