WHBE兔红细胞免疫功能增龄变化及其与CR1基因表达的相关性研究

姚盼盼 李吉二 陈民利 潘永明 赵伟春

摘 要：为揭示白毛黑眼兔（WHBE兔）红细胞免疫粘附功能增龄性变化规律及其与补休受体1（CR1）基因表达的相关性，对幼年、青年、成年和老年的日本大耳白兔（JW兔）和WHBE兔耳中央动脉采血，采用补体致敏和未致敏的酵母菌花环试验测定红细胞免疫粘附功能，荧光定量RT-PCR法检测兔骨髓中CR1基因 mRNA的相对表达量。随着年龄增长，两种实验兔的红细胞C3b受体花环率（E-C3bRR）均显著下降，红细胞免疫复合物花环率（E-ICRR）均显著上升，且成年和老年WHBE兔的E-C3bRR显著高于JW兔，幼年和青年WHBE兔的E-ICRR显著低于JW兔。JW兔和WHBE兔CR1 mRNA相对表达量均随年龄的增长而降低。两种实验兔红细胞免疫粘附能力随年龄增加而显著降低，且与骨髓CR1 mRNA的表达水平密切相关，WHBE兔红细胞免疫粘附能力显著高于同龄的JW兔。

关键词：白毛黑眼兔；日本大耳白兔；红细胞免疫粘附；补体受体1（CR1）基因

中图分类号：S852.4 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）24-0190-02

白毛黑眼兔（White Hair Black Eyes Rabbit，WHBE兔）是在1998年日本大耳白兔（Japanese White Rabbits，JW兔）生产群中发现一只雄性白毛黑眼兔，采用群体继代的选育方法，培育而建立一个新的实验兔品系—WHBE兔封闭群。它与目前常用的JW兔相比，具有心功能强、免疫反应敏感、产生抗体效价高、红细胞与网织红细胞低、淋巴细胞高、血液学参数指标与人类较为接近，提示WHBE兔可能是人类红细胞免疫功能和老化研究较好的模型动物[1-4]。因此，本實验在比较WHBE兔和JW兔红细胞免疫粘附功能的基础上，分析不同年龄实验兔补体受体1（complement receptor 1，CR1）基因mRNA表达量差异和红细胞免疫功能增龄性变化的相关性，为明确WHBE兔红细胞免疫功能的特性及其分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

按月龄选择幼年（0～3月龄）、青年（3～18月龄）、成年（18～30月龄）和老年（30月龄以上）的普通级WHBE兔和JW兔各共24只，每组雌雄各半。普通级雄性白化豚鼠1只，体重250～260g。购自新昌县大市聚镇欣健兔场【SCXK（浙）2015-0004】。

1.1.2 试剂

酵母多糖冻干试剂、淋巴细胞分离液、SP2/0骨髓瘤细胞株、单链cDNA合成试剂盒、Trizol试剂、Taq聚合酶、SYBR Green supermix、GAPDH基因引物F：5-CCACTTTGTGAAGCTCATTTCCT-3，R：5-TCGTCCTCCTCTGGTGCTCT-3；CR1基因F：5-TGTTTGACCTTGTGGGAGAAC-3，R：5-TACACTGAGGAGGAGGGCTGT-3。

1.1.3 仪器设备

荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、垂直板电泳槽、凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 红细胞悬液制备

实验前实验兔禁食8h，从耳中央动脉采血1.5mL，枸橼酸钠抗凝，加PBS液15mL及适量淋巴分离液，2000r/min离心5min，弃白细胞、血浆层及淋巴分离层，PBS洗涤3次，用HankS液配成1.3×107个/mL红细胞悬液。

1.2.2 致敏酵母菌悬液制备

豚鼠取血2mL，3000r/min离心10min分离血清。取酵母多糖冻干试剂1支，加入2mLPBS液，37℃水浴融化，2000r/min离心5min，弃上清，加1mLPBS和等量的豚鼠血清，混匀，37℃水浴30min，PBS洗涤，调整细胞浓度为1×108个/mL。

1.2.3 未致敏酵母菌悬液制备

制备方法基本同前，除了不加等量的豚鼠血清。

1.2.4 E-C3bRR及E-ICRR测定

取2支试管，每管加待测红细胞悬液50μL，第一管加致敏酵母菌悬液50μL，第二管加未致敏酵母菌悬液50μL，混匀，置于37℃水浴30min，0.25%戊二醛固定，取混合液少量涂片行HE染色并镜检阅片。每片计数200个红细胞，以一个红细胞粘附2个及以上酵母为一个花环，计花环百分率。

1.2.5 CR1 mRNA表达量的测定

成熟红细胞无核，其细胞膜上的CR1蛋白由骨髓幼稚红细胞的CR1基因表达而来[4]。因此，采集肝素钠抗凝的骨髓检测CR1 mRNA表达量。按试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA的第一链。PCR扩增体系：SYBR Green surpermix 12.5μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTPs 1μL，Taq酶1μL（1U），上、下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O补充至25μL。反应条件：94℃预变性30s，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，40个循环，72℃ 8min。以GAPDH为内参基因，计算mRNA相对表达量2-ΔΔCt。

1.2.6 统计学处理

实验数据用±Se表示，组间比较采用LSD法单因素方差分析，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同年龄实验兔的E-C3bRR变化

结果见图1和表1。JW兔和WHBE兔幼年时期粘附未致敏酵母菌的红细胞个数最多，随着年龄的增长，能粘附未致敏酵母菌的红细胞个数减少。青年组、成年组和老年组JW兔的E-C3bRR均显著低于幼年组（P<0.01），老年组显著低于青年组（P<0.01）；WHBE兔成年组和老年组的E-C3bRR亦显著低于幼年组（P<0.05，P<0.01）；JW兔成年组、老年组均显著低于同龄的WHBE兔（P<0.05）。

2.2 不同年龄实验兔的E-ICRR变化

随着年龄的增长，WHBE兔和JW兔能粘附致敏酵母菌的红细胞个数不断增加（图2），E-ICRR升高（表1）。其中JW兔成年组、老年组均高于幼年组和青年组（P<0.05，P<0.01）；WHBE兔各年龄组间的差异均有统计学意义（P<0.01）；幼年组、青年组JW兔的E-ICRR均显著高于同龄的WHBE兔（P<0.01）。

2.3 不同年龄实验兔CR1 mRNA的相对表达量变化

兩种实验兔幼年组的CR1 mRNA表达量均显著高于青年、成年和老年组（P<0.01），青年和成年组显著高于老年组（P<0.01）。同一年龄组两种实验兔间无显著差异。见表1。

3 结语

随着机体的衰老，其红细胞的免疫功能逐渐衰退。胎兔、新生兔的红细胞免疫粘附活性明显高于母体，且成年兔的抑制因子水平明显高于新生兔，表明动物在出生时红细胞就已具有较完善的补体受体系统及对C3b较强的粘附能力[5]。本实验结果显示，JW兔和WHBE兔红细胞免疫功能均呈增龄性下降，表现为其E-C3bRR增龄性下降，而E-ICRR则呈增龄性升高。这可能是由于在成长发育过程中，机体自身抗体增多，免疫复合物积蓄，红细胞C3b受体消耗过多，使红细胞C3b受体降低[6]。各种因素所致红细胞免疫功能继发性下降，这有别于诸如系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病时，红细胞表面受体缺陷所致的原发性红细胞免疫功能低下。

本研究结果表明，JW兔成年组、老年组的E-C3bRR均显著低于同龄的WHBE兔，而幼年组、青年组JW兔的E-ICRR均显著高于同龄WHBE兔，显示WHBE兔单个红细胞的免疫粘附能力显著强于JW兔，这可能是WHBE兔自身红细胞、网织红细胞和白细胞计数少于JW兔的一种适应机制[1-2]。此外，不同年龄WHBE兔增强免疫粘附能力的方式不同，其中幼年兔和青年兔通过降低E-ICRR来实现，而成年兔和老年兔则通过提高E-C3bRR来实现，但其作用的机制仍有待于进一步研究。

C3b受体基因是伴随第一对常染色体的隐性遗传基因，C3b受体的数量及活性主要由遗传因素决定，也与后天的环境因素有关[6]，并受血清中C3b受体粘附抑制因子的影响[7]。本研究结果显示，JW兔和WHBE兔骨髓CR1 mRNA表达量随着年龄增加逐渐减少。这表明，在正常生理状态下，CR1 mRNA表达水平与红细胞免疫能力呈正相关，随着机体老化，CR1 mRNA表达量降低，免疫能力下降，从而引起疾病发生。

参考文献

[1]周卫民，潘永明，陈民利，等.WHBE兔网织红细胞计数与分群测定[J].实验动物比较医学，2009，29（6）：411-414.

[2]应华忠，寿旗扬，陈民利，等.WHBE兔的血液学指标测定与比较[J].实验动物与比较医学，2010，30（1）：44-47.

[3]张纾瑜，陈文成.红细胞免疫研究进展[J].右江医学，2016，44（6）：718-721.

[4]Hazrati L N， Cauwenberghe C V， Brooks P L， et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease： A tentative disease mechanism. Neurobiology of Aging，2012，33（2）：2949.e5-2949.e12.

[5]叶润蓉，曹伊凡，白琴华.高原鼠兔红细胞免疫功能的研究[J].兽类学报，1995，15（4）：298-301.

[6]Walport M J， Lachmann P J. Erythrocyte complement receptor type 1， immune complexes， and the rheumatic diseases. Arthritis Rheum，1988，31（2）：153.

[7]Piche M S， Freenbern W J， Herbrand U. Assessing cell-mediated immune functions. Comprehensive Toxicology （Third Edition），2018，11：361-375.