一种重组人溶菌酶的纯化工艺研究

邓晗，史瑾，王维，郝东，王俊，杨小琳

摘 要：目的：以毕赤酵母表达的重组人溶菌酶（hLYZ，以下简称hLYZ）发酵液为原料，建立一种hLYZ纯化方法。方法：高速离心技术、膜过滤技术，超滤技术为主的粗纯工艺；应用离子交换色谱的精细纯化工艺。结果：以该纯化工艺可生产获得单一组分的hLYZ，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及反相高效液相色谱C18柱检测其纯度可达98%以上。结论：本工艺得到的hLYZ纯度大于98%、可用于进一步工业化研究。

关键词：hLYZ；超滤浓缩；离子交换层析；纯化

中图分类号：Q55 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）06-0176-03

Abstract： Objective： to establish a method for purification of human lysozyme （hLYZ） from the fermentation broth of recombinant human lysozyme （hLYZ） expressed by Pichia pastoris. Methods： high speed centrifugation， membrane filtration and ultrafiltration were used for crude purification， and ion exchange chromatography was used for fine purification. Results： a single component of hLYZ could be obtained by this purification process. The purity of hLYZ could reach more than 98% by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and RP-HPLC C18 column. Conclusion： the purity of hLYZ obtained by this process is more than 98%， which can be used for further industrial research.

Keywords： hLYZ； ultrafiltration concentration； ion exchange chromatography； purification

引言

溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶，溶菌酶广泛的存在于高等动物组织及分泌物、鸟类和家禽的蛋清中也含有此酶、其中以鸡蛋清中含量最高[1-2]。它是一种无毒、无副作用的蛋白质，具有一定的溶菌作用，可作为食品防腐剂。同时它具有抗菌、抗病毒等多种作用[3]。溶菌酶还具有破坏细胞壁结构的功能，因此溶菌酶成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶[4]。随着生物工程的迅速发展，溶菌酶应用价值将会越来越重要。目前用于溶菌酶分离纯化的方法主要有结晶法[5-6]、离子交换法[7-8]，特别是现在采用的新技术如膜分离技术[9-10]、超滤法、亲和-膜过滤技术等[11-12]。

与其他来源溶菌酶相比，人溶菌酶具有其优越性和多种药理作用，在临床上也具有重要价值。 因此分离纯化得到高纯度hLYZ，产品用于进一步科学研究就显得尤为重要。但天然溶菌酶来源及其困难，DNA重组技术进行生产是解决这一困难的有效途径，现已利用化学合成或从人细胞组织中制备cDNA等途径获取人溶菌酶基因，并在大肠杆菌，酵母菌等表达系统进行了表达，由于其表达水平不高，再加上后期纯化工艺损失，总体收益较低， 因此目前国内外对于hLYZ纯化工艺研究相对较少，本工艺运用固液分离技术，超滤技术、离子交换层析技术得到纯度大于98%的hLYZ产品，符合工业化生产要求，且工艺相对简单易操，可用于进一步的工业化研究。

1 材料和方法

1.1 仪器

辽阳阳光三足式离心机（SSC600-NG）、0.22um除菌滤器、天津膜天膜中空纤维膜组件、武汉新力协力超滤膜组件、AKTA purifiers 100、北京六一电泳仪、日立HPLC 、C18层析柱（中科院大连化学物理研究所）。

1.2 试剂及材料

（1）试剂。十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、盐酸以及电泳相关试剂均为国产分析纯；去离子水；超纯水；乙腈及三氟乙酸均为色谱纯；CM Sepharose Fast Flow（保赛恒成生产，批号：20131120）。对照品LYZ：sigma Lysozme hunman（L1667）。（2）材料。本公司201705003-50L批hLYZ發酵液。

1.3 方法

（1）hLYZ粗纯。发酵液经沉降式离心机转速2000转/分钟，离心60分钟进行固液分离；收集上清，上清经0.22um中空纤维膜过滤系统，去除残余菌体、细胞碎片以及部分杂质；收集0.22um滤出液用5k卷式超滤膜超滤浓缩脱盐。（2）hLYZ阳离子交换层析。a. 样品处理：最终收集收集的浓缩液中加入0.05M磷酸二氢钠溶液，调节pH7.5-8.0，电导6.0-7.0 mS/cm，配成上样溶液备用。b. CM阳离子交换层析纯化：配制流动相A：pH7.6 50mM磷酸盐缓冲液，pH7.5-8.0之间，电导6.0-7.0 mS/cm；B：pH7.6 50mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl，pH7.5-8.0之间。将a中的hLYZ样品上CM FF层析柱，样品上样完成后，用A相平衡，10%B相洗脱为杂质，16%B洗脱液为hLYZ。

1.4 分析检测

（1） Tricine-SDS-PAGE电泳检测。hLYZ分子量为14.7Kd，故采用15%的分离胶分别对粗纯样品以及离子交换层析样品进行分析检测，先60v电压 60min，再120v电压150min。电泳完成后用固定液固定30min，再用R250染色30min，最后用脱色液脱色。（2）HPLC对hLYZ纯度分析。采用HPLC对纯化后hLYZ进行纯度分析，色谱柱为C18柱，流动相A：生理盐水+0.1%TFA；B相为60%已腈+40%生理盐水，色谱分析程序为40B-70B 30min。检测波长为215nm。

2 结果

2.1 hLYZ纯化

hLYZ发酵液先进行固液分离；去除酵母细胞以及不溶性杂质，在过0.22um中空纤维膜过滤系统，进一步去除残余菌体、细胞碎片以及部分大分子物质等；最后用5k卷式超滤膜超滤浓缩脱盐出去部分小分析物质。

将5k脱盐浓缩后的hLYZ加入0.05M磷酸二氢钠溶液，调节pH7.5-8.0，电导6.0-7.0 mS/cm，分別用10%，16%的B相进行阶梯洗脱，16B洗脱为目标蛋白，见图1。

2.2 Tricine-SDS-PAGE电泳检测

对分离纯化得到的hLYZ采用Tricine-SDS-PAGE电泳分分析检测其纯度，检测结果如图2所示，分离得到的hLYZ分子量在14.4kd，与对照品LYZ电泳迁移位置一致，且整个电泳条带中杂带较少，纯度较高。

1：蛋白分子量标准；2：对照品LYZ；3：纯化后hLYZ

2.3.HPLC纯度分析

经高效液相色谱分析表明：纯化后hLYZ出峰时间为16.03min，对照品hLYZ出峰时间为15.96min。纯化后hLYZ与对照品hLYZ出峰时间基本一致，采用面积归依法计算峰面积，得到hLYZ产品纯度98.3%，hLYZ产品检测色谱图如图3 ，hLYZ对照品出峰时间如图4。

3.结束语

本方法采用传统的固液分离技术、过滤技术以及超滤技术得到hLYZ粗品，经一部阳离子交换层析得到纯度位98.3%的hLYZ产品。目前国内外对于hLYZ的研究较少，且大部分集中在对蛋清等其他来源的溶菌酶的研究，而对人溶菌酶的研究相对较少，分离纯化方面的研究鲜有报道，本工作初步建立了一种以超滤过滤技术粗纯，阳离子交换层析技术精纯的hLYZ高纯度分离纯化工艺，工艺进一步优化后，有望进行高纯度大规模的生产。

参考文献：

[1]凤权，汤斌.溶菌酶分离纯化方法的研究进展[J].生物学杂志，2006，23（1）.

[2]宋娟.溶菌酶分离方法及进展[J].河南化工，2017，34：16-17.

[3]林立.溶菌酶分离方法综述及进展[J].广州化工，2012，40（7）： 53-56.

[4]Paola A，Joseph H.H.Immobilization of lysozyme on food contact polymers as potential antimicrobial films[M].Packaging Technology and Science， 1997，10：271-279.

[5]Alderton G，Ward W，Fevold H.Isolation fo lysozyme from egg white[J].Journal of Biological Chemistry，1945，157：43-58.

[6]杨景芝，孙衍华，白吉刚，等.鸡蛋清溶菌酶提取工艺的改进[J].食品与发酵工业，2004，30（5）：85-87.

[7]余海芬，马美湖，刘岩.阳离子交换法提取蛋清溶菌酶的研究[J].中国家禽， 2008，30（24）：22-25.

[8]宋宏新，薛海燕，杨芳.鸡蛋壳溶菌酶分离纯化工艺研究[J].食品工业科技， 2003，9：60-63.

[9]李静，陈欢林，柴红.金属螯合亲和膜吸附分离与纯化溶菌酶的研究[J].膜科学与技术，2001.21（4）：5-9.

[10]Raja. G Protein purification by ultrafiltration with pretreated mem -brane[J].Journal of membrane Science，2000，49-54.

[11]李存芝，李琳，胡松青，等.亲和膜过滤技术及其应用[J].现代化工，2004， 1（24）：64-66.

[12]陈萍，赵玮，李琳，等.水溶性葡聚糖亲和超滤载体对溶菌酶吸附分离特性的研究[J].食品工业科技，2011，32（8）：84-86.