抚州市中心血站核酸检测试点实验室结果分析

范彩霞

(江西省抚州市中心血站，抚州 344000)

为了确保临床用血安全，提高窗口期和变异病毒株的检出，最大限度地减少方法学引起的差异，国家卫计委强烈地要求全国的采供血机构需全面普及核酸检测。抚州市中心血站从2015年6月开始严格按照国家卫生和计划生育委员会下发的《关于做好血站核酸检测工作的通知》的要求筹建核酸实验室，2016年全面开展 HBV、HCV和HIV(1型)核酸检测用于临床用血的筛查。本文通过对2016年我站的献血者20763例标本酶联免疫吸附联合核酸检测结果进行分析，探讨核酸检测用于献血者临床输血安全筛查的重要性。

1 材料与方法

1.1 标本来源 采集2016年1-12月抚州市中心血站20763位无偿献血者血浆。所有无偿献血者均符合我国GB18467《献血者健康检查要求》的标准。采血后留取真空抗凝管5ml，所有标本均在冷链保证情况下送到站内，低温离心保存，在72h内完成输血前检测。

1.2 仪器与试剂 ELISA检测试剂盒由厦门新创科技有限公司和北京万泰科技有限公司提供。ChiTaSBSS1200全自动核酸提取仪 （苏州新波生物技术有限公司）及配套试剂和ABI 7500实时荧光定量PCR仪 （爱普拜斯应用生物系统公司）。HBV、HCV和HIV(1型)核酸检测试剂盒Real Time-PCR由上海浩源生物科技有限公司提供。所有试剂均在有效期内使用。

1.3 ELISA血清学检测 用厦门新创和北京万泰二种ELISA检测试剂盒同时对20763份无偿献血者标本进行HBV抗原、HCV和HIV抗体检测。一种ELISA方法检出阳性或二种均为阳性的标本剔除。两次ELISA该三项指标均为阴性且其他项目检测合格的样本进行8混样混合后做HBV-DNA、HCV-RNA、HIV(1型)-RNA核酸检测。

1.4 核酸提取和PCR扩增 参照试剂盒说明书用ChiTaSBSS1200系统及配套试剂进行荧光PCR检测HBV-DNA、HCV-RNA、HIV(1型)-RNA 病毒核酸。病毒核酸提取采用磁珠法，血浆标本及内对照经裂解液处理后释放出基因组核酸，加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的磁珠颗粒表面。纯化的病毒及内对照核酸在洗脱液提供的环境及特定温度下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为PCR扩增的模板。PCR扩增检测采用TagMan荧光探针标定技术。HBV、HCV、HIV(1型)病毒核酸扩增在同一管内分别采用不同荧光染料标记的探针，故可同时检测该3种病毒核酸。在反转录酶的作用下HCV-RNA/HIV(1型)-RNA/内对照RNA反转录成cDNA，再与HBV-DNA/内对照DNA一同作为模板在TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域和内对照特定区域。TaqDNA聚合酶5′-3′外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针产生荧光信号，随着PCR反应的进行，荧光信号不断积累。Real Time-PCR法通过检测达到和超过荧光阈值的信号给出标本的阴阳性结果。核酸检测阳性样本送国家卫计委临床检验中心做比对试验。

2 结果

2.1 ELISA检测结果 20763份无偿献血标本中有20426份合格标本用于核酸检测。其中不合格标本为HBsAg阳性标本194份、抗-HCV阳性标本34份、抗-HIV-1/2阳性标本13份。其他项目不合格标本共99份，其中抗-TP 46份，ALT53份（见表1）。

2.2 核酸检测结果 对20426份血清学检测结果合格的标本进行核酸检测结果为核酸反应性标本50例（HBV-DNA49例及HIV(1型)-RNA 1例），核酸反应性标本阳性率2.45‰。最后将这50例核酸反应性标本连同血浆袋一起送往国家卫计委临检中心做比对试验，其结果是49份HBV-DNA阳性标本中有45份为阳性，4份为阴性；1份HIV(1型)-RNA阳性标本经国家卫计委临检中心检测为阴性（见表2），核酸检测阳性符合率为90%，符合国家相关要求。

3 讨论

从表1、2中可以看出核酸检测联合酶联免疫吸附实验比单纯的ELISA检测更安全。酶联免疫吸附法的检测方法较为局限性，以窗口期进行，细胞抗原、抗体的蛋白结构易变性，纯粹的抗体、抗原ELISA检测还是具有一定的输血安全风险性。而NAT检测的是病毒核酸。两者在检测原理及方法上均存在差异。本实验室曾将ELISA检测抗-HCV阳性的标本进行NAT检测，结果并非都是NAT阳性，所以两种方法的检测结果有互补之效。增加NAT检测是对ELISA的有效补充，能够使现有的献血体系更加完善，使输血传播疾病的风险降到最低。为了保证血液质量及输血安全，在献血者血液筛查的两遍酶免检测的基础上增添核酸检测是很有必要的[1-4]。

2016年采集的20763份标本中，ELISA检测合格标本数为20426份，阳性标本数为337份，其中包括HBsAg阳性标本194份；有1份标本既是HBsAg阳性又是抗-TP阳性标本；有2份标本既是HBsAg阳性又是ALT不合格标本；ALT不合格标本53份，分别占不合格标本的58.46%和16.32%。由此可见，在我们的无偿献血人群中感染乙肝的人群占了较大的比例[5]，其次是ALT不合格的人群。

表1 2016年抚州市中心血站无偿献血者ELISA法检测结果表

表2 50例核酸反应性标本检测结果及国家卫计委临检中心检测结果对照表

另从核酸及ELISA检测结果分析表明，在乙型肝炎病毒 （HBV）感染检测中，NAT除可缩短HBV感染检测的窗口期外，还可减少HBV急性感染恢复期、慢性隐匿性HBV感染以及变异病毒株感染的漏检。有文献报道[6，7]，核酸检测技术平均可将HBV、HCV、HIV感染 “窗口期”由原来的56d、82d、22d， 缩短至 33d、22d、11d， 分别缩短 40%、73%和50%。由此可见，核酸检测 （nucleic acid test，NAT）可以有效地缩短病毒特异抗原和抗体免疫测定的“窗口期”。

综上所述，核酸检测技术能有效地降低酶联免疫法漏检造成的输血风险，故核酸检测和酶联免疫检测相结合做为血液筛查检测的重要手段，可以大大地提高输血安全。