用五种标准物质的稳定性评价实验动物遗传质量研究

王 洪 魏 杰 邢 进 巩 薇 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

无论是药物的研发还是药品的质量控制都离不开动物实验，动物实验必须要使用标准化的实验动物才能获得重复性好，具参考性的实验结果。而标准化的实验动物必须通过全方位的质量控制来实现。遗传质量控制是其中尤为重要的一环。遗传质量控制的主要方法之一是生化标记检测法。该方法是实验动物遗传质量控制的经典方法。选择一些在品系间具有多态性的同工酶和异构蛋白作为生化标记，生化标记的差异体现的是编码该生化标记的DNA序列的差异。不同品系具有各自独特的生化标记基因。生化标记检测法涵盖14个生化标记位点，每个位点都需要相应的标准物质用于实验动物遗传质量评价的结果判定。标准物质的研发与应用，一方面可以节约检验时间，提高工作效率；另一方面可以有效减少实验动物的使用量，符合动物伦理和3R原则[1-2]。

生化标记检测法的14种标准物质主要应用于实验动物的遗传质量评价，同时也在实验动物领域的能力验证活动中广泛应用。本研究主要对5个生化标记(苹果酸酶-1、异柠檬酸脱氢酶-1、碱性磷酸酶-1、过氧化氢酶-2和肽酶-3)标准物质的稳定性展开研究。评价温度和时间对5种标准物质的影响。以期获得该标准物质的保存条件和运输条件，为实验动物遗传质量评价使用标准物质的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10只SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠和10只SPF级8周龄雌性BABL/c小鼠，均来源于国家啮齿类实验动物种子中心[SCXK(京) 2014—0013]。10只SPF级8周龄雌性CBA小鼠，来源于上海斯莱克有限公司[SCXK(沪) 2012—0002]。按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 样品制备

采用安乐死处死动物，剖腹，取小鼠肾脏2只，加入预冷的蒸馏水，蒸馏水与肾脏的比例为2∶1(V/W)。用组织匀浆器匀浆，然后置4 ℃低温高速离心机中，15 000 r/min，30 min。取上清，加保护剂，分装，装量70 mg/瓶，用冻干机，冻干。小鼠肾匀浆冻干样品为红色固体。加盖，封口膜封口，封口袋包装。采用随机数字方式编号。贮藏条件为密封，冷藏[3-5]。

1.3 稳定性检验[6]

1.3.1分别将时间和温度设为横、纵坐标，设定-20 ℃，4℃，室温和37 ℃ 4个温度检验点，设定1、2、3、7、14、30、60、90 d为8个时间检验点，在每个坐标交点，随机抽取1瓶进行检验。

1.3.2在取出日期，依据国家标准GB/T14927.1—2008对样品进行检测，观测稳定性结果[6]。所有样品均需加入70 μL蒸馏水还原。

1.3.3记录不稳定结果出现的时间和温度，本测定的观测周期为90 d时长。

1.3.4汇总稳定性结果，填写各自时间、温度稳定性结果报告单。

1.3.5稳定性结果判定：如发现任何1瓶发生条带模糊不可读，则认为在该观测点样品的稳定性已经发生了变化，即在该时间温度条件下该样品不稳定。

2 结果

共制备碱性磷酸酶-1标准品60份。肽酶-3、过氧化氢酶-2、苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1标准品共178份。

苹果酸酶-1样本在37 ℃条件下稳定至第1天，在保存至第2天时，条带模糊，无法辨认。在室温条件下，该样本可稳定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以稳定保存至90 d。异柠檬酸脱氢酶-1样本在37 ℃条件下稳定至第1天，在保存至第2天时，条带模糊，无法辨认。在室温条件下，该样本可稳定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以稳定保存至90 d。碱性磷酸酶-1样本在37 ℃条件下稳定至第1天，在保存至第2天时，条带模糊，无法辨认。在室温条件下，该样本可稳定保存至5 d。在4 ℃和-20 ℃可以稳定保存至90 d。过氧化氢酶-2样本在37 ℃条件下稳定至第3天。在室温条件下，该样本可稳定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以稳定保存至90 d。肽酶-3样本在37 ℃条件下稳定至第1天，在保存至第2天时，条带模糊，无法辨认。在室温条件下，该样本可稳定保存至14 d。在4 ℃和-20 ℃可以稳定保存至90 d。详见表1。

如图1所示，在室温条件下，苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1的标准物质放置1、2、3、7 d和14 d的电泳条带，1、2和3 d的条带清晰可见。7 d和14 d的电泳条带模糊，无法辨认。如图2所示，在4 ℃和-20 ℃条件下，碱性磷酸酶-1的标准物质放置30 d、60 d和90 d的电泳条带，清晰可见。如图3所示，在4 ℃和-20 ℃条件下，过氧化氢酶-2的标准物质放置30 d、60 d和90 d的电泳条带，清晰可见。如图4所示，在4 ℃和-20 ℃条件下，肽酶-3的标准物质放置30 d、60 d和90 d的电泳条带，清晰可见。

表1 五种标准物质的稳定性检验结果Table 1 Stability results of 5 standard substances

图1 苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1 在室温条件下的电泳结果注： 1∶1d； 2∶2d； 3∶3d； 4：Marker1(b,a)；5：Marker2(b,b)； 6：Marker3(a,a)；7:7d； 8：14d Fig.1 Electrophoresis results of Mod1 andIdh1 in room temperatureNote: 1:1d； 2:2d； 3:3d； 4：Marker1(b,a)；5：Marker2(b,b)；6：Marker3(a,a)；7:7d； 8:14d

图2 碱性磷酸酶-1在4 ℃(1-3)和-20 ℃(7-9)存放后的电泳结果注：1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(b)； 6：Marker3(b)； 7：30d； 8：60d； 9：90dFig.2 Electrophoresis results of Akp1 in4 ℃(1-3)and -20 ℃(7-9)Note: 1：30d； 2：60d； 3：90d； 4：Marker1(a)；5：Marker2(b)； 6：Marker3(b)；7：30d； 8：60d；9：90d

图4 肽酶-3在4 ℃(1-3)和-20 ℃(7-9)存放后的电泳结果注：1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(a)； 6：Marker3(b)； 7：30d； 8：60d； 9：90dFig.4 Electrophoresis results of Pep3 in 4 ℃(1-3)and -20 ℃(7-9)Note: 1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(a)； 6：Marker3(b)；7：30d； 8：60d；9：90d

3 讨论

3.1 贮存条件和运输条件

温度升高将导致蛋白质的生物学活性丧失，酶的生物学功能失效。生化标记方法是通过生物化学方法染色来识别不同品系动物在各生化标记位点的差异。一旦酶的生物学功能丧失，将无法通过酶类的不同基因型将不同品系的动物区分开来。标准物质一旦丧失稳定性，将无法作为实验动物遗传质量的评判标准。因此，温度是决定标准物质稳定性的重要因素之一。本研究选择了4个温度点和8个时间点。选择室温，而不是设定为25 ℃，是希望温度条件尽量接近真实情况。本研究工作的实施时间是在北京5—7月。室温在30 ℃左右。以肽酶-3为例，本研究中肽酶-3在室温条件下可以稳定保存14 d。而有研究发现，在北京1—2月，室温在20 ℃左右的情况下，肽酶-3标准物质可以在室温稳定存放28 d。因此，室温状态下的实际温度，因地域而异，因季节而异。标准物质不应在室温状态下长期存放。在4 ℃和-20 ℃条件下，5种标准物质均可以稳定保存至90 d。可见，4 ℃和-20 ℃是适于标准物质长期保存的温度。而37 ℃对于标准物质来说，是极不稳定的温度。除了过氧化氢酶-2可以稳定3 d以外，其它4种标准物质只能稳定1 d。因此，在标准物质制备完成到使用之前的贮存条件应严格控制在4 ℃以下。如果涉及到标准物质的运输，应全程控制温度。因此，无论是标准物质的贮存，还是标准物质的运输都必须严格控制温度。

3.2 不同位点的稳定性存在差异

国家标准中的14个生化标记的标准物质，对温度的敏感程度各不相同，不同位点的稳定性存在差异。过氧化氢酶-2比其他位点在37 ℃稳定的时间更久(3 d)。不同位点需要分别做稳定性检验。保证标准物质的稳定性，同时也是遗传质量评价工作顺利开展的保障[7]。

3.3 标准物质在能力验证活动中的应用

标准物质的稳定性对于能力验证活动的开展也至关重要。能力验证可通过实验室间比对，确定实验室的检测或校准能力，能力验证样品的一致性对能力验证的整个过程至关重要。在实施能力验证计划时，组织方应确保能力验证中出现的不满意结果不归咎于样品之间或样品本身的变异性。因此，对于能力验证样品的检测特性量，须进行均匀性检验和(或)稳定性检验。国家实验动物遗传质量检测中心负责全国实验动物质量检测机构遗传生化标记位点碱性磷酸酶-1等14个项目的能力验证评价计划的实施。我们通过评价碱性磷酸酶-1、过氧化氢酶-2、肽酶-3、苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1这5种标准物质的稳定性，以确保发出的能力验证样品完全符合要求。在能力验证提供者认可评审以及监督评审中，样本的稳定性检验都是重要的考察项[3]。

通过本研究发现标准物质在室温波动较大和37 ℃极不稳定，在4 ℃和-20 ℃，可以长期稳定。说明标准物质是一类对温度较为敏感的物质。有必要严格控制标准物质的保存条件和运输条件。依据本研究获得的稳定性检验的数据可以为标准物质的应用提供技术保障。