GeneXpert MTB/RIF技术在勐海县肺结核快速诊断及耐药结核筛查中的应用

陈燕，张霞，杨娅萍，杨梦雪

云南省西双版纳州勐海县人民医院感染性疾病科，云南西双版纳 666200

根据WHO的《2017全球结核病报告》，中国仍然是全球结核病(TB)、耐多药结核病（MDR-TB）和HIV合并结核病（TB/HIV）高负担国家之一。在我国传染病疫情网络报告中，肺结核发病和死亡人数始终居于各类传染病的前列。其中，3/4的肺结核患者为最具有劳动能力的青壮年。结核病仍是制约农村地区特别是贫困地区经济和社会发展的重大疾病之一[1]。该州是云南省结核病流行较为严重的地州之一，2017年勐海县肺结核发病率位居云南省第三，且持续面临耐药结核病的威胁，早期诊断和及时合理治疗可避免结核病的传播，减少死亡率，《WS 288—2017肺结核诊断》标准中指出，结核病的诊断原则是以病原学(包括细菌学和分子生物学)检查为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像学检查、相关的辅助检查及鉴别诊断等进行综合分析做出诊断[2]。在病原学检查中，传统的抗酸杆菌直接涂片一直是基层医院能获得病原学检查结果的最直接途径，但痰涂片检出率较低，不能区分非结核分枝杆菌 （NTB），不能及时发现耐药结核患者，已不能满足目前临床需求和结核病控制需求；而结核病诊断的金标准痰培养因培养周期长，生物安全要求高，大部分基层医院均未能开展，这使得部分菌阳肺结核，特别是耐药肺结核患者不能及时发现，精准治疗，导致耐药菌株的传播，耐药病例增加。GeneX-pertMTB／RIF是一种全自动半巢式实时荧光定量PCR体外分子诊断技术，该技术集标本处理、DNA提取、核酸扩增、结核分枝杆菌特异核酸检测、RIF耐药基因 rpoB突变检测于一体，手工操作仅需 5 min，并且由于整个过程在封闭的检验腔室内自动化完成，使得样品之间的交叉污染最小化，无需生物安全需求[3]。2 h之内即可诊断是否感染结核分枝杆菌及对RIF耐药[4-5]。该技术被WHO誉为结核病诊断中革命性的突破。该文通过对2017年8月—2018年4月底在勐海县人民医院感染科就诊的500例患者的痰标本进行GeneXpertMTB／RIF检测和痰抗酸杆菌涂片检查，将结果分析汇总，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在勐海县结核定点医院勐海县人民医院感染科就诊的临床诊断肺结核患者共500例，患者来源于因症就诊或非肺结核定点医院转诊。其中男性332例，女性168例，年龄13～87岁，平均年龄46.03岁。

1.2 肺结核诊断

肺结核诊断依据 《肺结核诊断标准》(WS288－2017)[6]。

1.3 标本的收集

收集在勐海县结核定点医院感染科就诊的500例临床诊断肺结核患者的痰液，由医护人员指导患者采集合格的痰液标本，分别留取即时痰、夜间痰及晨痰，采用直接涂片法进行痰抗酸菌涂片检查；同时留取晨痰1 mL进行GeneXpertMTB／RIF检查。为了提高痰标本的质量，所有标本均在使用抗生素及抗结核药治疗前完成，痰标本留取后及时送检，最长不超过2 h。

1.4 研究方法

根据涂片结果分为两组，其中痰涂片阴性为涂阴组，痰涂片阳性为涂阳组。对检查结果情况进行整理、分析，评估GeneXpertMTB／RIF检测系统在勐海县临床诊断肺结核患者中结核分枝杆菌检出率和RIF耐药患者检出率。

1.5 评价标准

1.5.1 痰涂片检查 采用萋-尼氏染色法，按标准化操作程序操作，抗酸染色试剂为贝索公司（Baso）的抗酸染液。

1.5.2 GeneXpertMTB／RIF检测 设备为美国赛沛公司（Cepheid）生产的Gene XpertMTB/RIF检测系统，该系统使用实时 PCR，整合并自动进行样品纯化、核酸扩增、目标序列测定。按照仪器说明书要求规范操作：取1 mL痰标本，与4%氢氧化钠及异丙醇的处理液(SR)按1∶2比例混合，然后将其置于涡旋振荡器上进行涡旋振荡 30 s，室温静置15 min，使标本液化，吸取2 mL样品加入到反应试剂盒中，再将试剂盒放入GeneXpert仪器中进行自动检测。2 h出检测结果。

1.6 统计方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰抗酸杆菌涂片的检测结果

500例痰液标本中，抗酸杆菌涂片阳性标本45例，阳性率为9.0%（45/500），阴性标本455例，阴性率为 91%（455/500）。

2.2 GeneXpertMTB的检测结果

500例痰液标本中，检测阳性113例，阳性率为22.6%（113/500）。检出 RIF耐药 9例，耐药率为7.96%（9/113）,报告显示利福平耐药“不确定”的结果3例，不确定率为2.65%（3/113）。见表1。

2.3 痰涂片阳性患者中GeneXpertMTB/RIF的检出率

在痰抗酸杆菌涂片阳性的45例中GeneX-pertMTB阳性41例，阳性率为91.00%（41/45），其中，检出RIF耐药5例，耐药率为12.2%（5/41）。

2.4 痰涂片阴性患者中GeneXpertMTB/RIF的检出率

在痰抗酸杆菌涂片阴性的455例中GeneX-pertMTB阳性72例，阳性率为15.82%（72/455）。其中，检出RIF耐药4例，耐药率为5.56%（4/72）。报告显示利福平耐药“不确定”3例均为痰涂片阴性患者，不确定率为：4.17%（3/72）。 见表 2。

3 讨论

及时准确的发现肺结核患者是控制肺结核病的关键环节，痰涂片阳性率因受痰液质量、涂片技术、病变在肺野的位置、病灶是否开放及镜检人员责任心等因素影响，导致阳性率较低，该文显示500例患者中痰涂片阳性仅9.0%,国内学者对1171例痰标本进行痰涂片检查，阳性率也仅为 13.0%[7]，为了诊断肺结核和RIF耐药，实验室工作变得复杂而精细，各种培养方法需要在具有严格生物安全防护措施的实验室进行，还需要高度训练有素的技术人员操作，而且培养周期较长[8]，罗氏培养法耗时8周没有分枝杆菌菌落才能报告阴性，近年来结核菌快速培养虽然明显缩短了培养所需的时间，但也需1～3周才能检测到分枝杆菌生长。这无疑延缓了诊断的时间，增加了传播的机会，在基层医院，受条件限制，一直以来，缺乏一种快速准确的检查手段和方法及时发现肺结核及耐药结核患者，WHO发布的 《2017全球结核病报告》中指出，2016年新增60万例RIF（最有效一线药）耐药病例，其中49万是耐多药结核，这些病例几乎一半（47%）发生在印度、中国和俄罗斯联邦[9]，复旦大学基础医学院高谦研究团队与上海市疾病预防控制中心梅健教授研究团队合作，以确凿证据证明，至少73%的MDR-TB由传播导致，传播主要发生在社区和公共场所，诊断不及时是传播的主要危险因素，MDRTB在传播过程中不断进化，通过补偿性突变，提高自身的适应能力，产生新的耐药，成为更加难治的广泛耐药结核（XDR－TB）患者[10]。 目前，GeneXpert MTB/RIF对肺结核和耐药结核的高敏感性和高特异性已是国内外公认[11]。可以预见，我们发现的9例利福平耐药患者可能只是勐海县耐药结核病疫情中的冰山一角，在社区，在农村还有很多耐药结核患者在等待我们去发现，GeneXpert MTB/RIF技术优势在于能够在2 h内同时检测结核分枝杆菌和RIF耐药，有利于进行耐药监测，有利于尽早对菌阳结核患者及耐药结核患者的密切接触者进行筛查和采取合适的防护措施，能够让肺结核患者较早的得到正确的诊断和治疗。从而减少结核病的传播。为了快速筛查肺结核及耐药结核，勐海县人民医院自2017年开始引入GeneXpert MTB/RIF检测技术并开展了相关的检测工作。该研究显示，在500例患者中，GeneXpert MTB/RIF检测出阳性113例，占 22.6%，高于痰涂片的9.00%，两者之间的差异具有统计学意义 （χ2=5.853，P＜0.05）。 涂阳组 45 例标 本中， GeneXpert MTB/RIF阳性41例，阳性率为91.00%，有4例涂阳患者GeneXpert MTB/RIF检测为阴性，分析原因为痰涂片不能区分非结核分枝杆菌，而GeneXpert MTB/RIF只能检测到结核分枝杆菌，限于条件，未能对该4例怀疑为非分枝杆菌感染的标本进行进一步鉴定，涂阴组455例患者中，GeneXpert MTB/RIF检测出阳性72例，阳性率为15.82%，说明GeneXpert MTB/RIF检测在痰涂阴性患者中同样具有较高的应用价值。涂阳组和涂阴组在GeneXpert MTB/RIF检出率方面差异有统计学意义（χ2=52，P＜0.05），在利福平耐药检出率方面差异无统计学意义（χ2=2.483，P＞0.05）。该研究有3例报告利福平耐药 “不确定”，Cepheid公司认为是标本中的结核分枝杆菌浓度非常低，导致利福平耐药无法判读[12]。共发现 9例RIF耐药患者，RIF耐药率为7.96%，高于2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告中的耐多药率6.8%。GeneXpert MTB/RIF因能较早的识别出耐药，因而可以尽早采取隔离措施和正确的治疗方案，可以对密切接触者进一步筛查和采取必要的干预措施，避免耐药结核的进一步传播。同时，GeneXpertMTB／RIF系统技术以半巢式实时定量PCR技术为基础，整合了传统的PCR所需的样品设备、核酸提取、扩增、目标序列检测等全部步骤，整个过程在封闭的腔室内自动化完成，无环境污染，可在低风险结核病实验室展开，操作简便、快捷。

表1 痰抗酸杆菌直接涂片与GeneXpert MTB/RIF检测阳性率对比[n（%）]

表2 涂阳组与涂阴组GeneXpert MTB/RIF检测阳性率及RIF耐药率对比[n（%）]

综上所述，GeneXpert MTB/RIF能够较早的识别出结核病患者，在及时识别耐药患者方面，更是具有目前其它检测手段不可比拟的优势，现阶段虽不能完全代替痰培养检查，但因其准确、快速、高效的特点，对于结核病，特别是耐药结核病的早期诊断、临床合理用药、密切接触者筛查，防止结核患者因检查周期长而在等待检查结果过程中丢失和等待期间造成的疾病传播等方面均具有比较积极的意义，且生物安全性高，便于在基层医疗机构开展。如果我们能利用GeneXpert MTB/RIF较早的发现结核和耐药结核患者，早期干预，减少传播，结合分离培养进一步完善药敏试验，指导治疗，将极大的促进肺结核防控工作。