胚胎停育和人流后组织中基因变化分析

李妺　南芳芳

【摘 要】目的：通过运用高通量测序技术来研究染色体异常所导致的流产遗传机制，并探寻胚胎停止发育和绒毛组织中染色体发生异常的相关危险因素，有利于科学的干预、指导育龄期女性出现胚胎停止发育的现象。方法：采集发生胚胎停育的94名患者的流产后绒毛组织（2017年5月至2018年5月，山东省东营市胜利石油管理局胜利医院妇科），标本培养后运用高通量测序技术对染色体进行核型分析。结果：收集标本全部培养成功，检测结果中染色体结构异常5例；染色体数目异常37例；异常核型49例。结论：染色体异常是导致胚胎停育的重要原因。及时发现并治疗，对优生优育有重大意义。

【关键词】胚胎停育；绒毛组织；高通量测序

【中图分类号】R394.2 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2018）23--01

高通量测序（High-Throughput Sequencing）又称下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。高通量测序技术具有高解析度、高输出量的特性，极大的减少了测序的费用和时间，发现核型分析技术检测不到的CNV。作为疾病的一项生物学标志，染色体的扩增和缺失等变化，已经成为许多疾病的研究热点。异常DNA拷贝数变异（CNV，Copy number variations）是导致人类许多疾病（遗传性疾病、癌症等）的重要分子机制。致病性的CNV可以导致胚胎停育，如果发现该类CNV，即可告知孕妇（自然受孕很难得到健康的孩子）需要进行辅助生殖技术受孕，对实现优生优育具有极其重大的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取发生胚胎停育的94名患者（2017年5月至2018年5月，山东省东营市胜利石油管理局胜利医院妇科），经手术清宫或药物流产后，收集的94例绒毛组织标本作为研究对象。采集标准：患者年龄：23-43岁（其中高龄孕妇16人，试管婴儿5人）；孕周：6-10周（均为单胎妊娠）。纳入标准：所有患者对本组研究完全知情同意，均明确为胚胎停育；超声检查无原始血管波动，无胚芽[1]。排除标准：感染因素患者；家族遗传史；免疫功能异常；凝血机制障碍[2]。

1.2 研究方法

1.2.1 采集样本情况：患者均因胚胎停育行清宫术或药物流产终止妊娠，终止妊娠后采集标本量不低于10mg的绒毛组织。

1.2.2 母体污染观察：将绒毛用生理盐水反复冲洗5-10次，冲洗（母血及污染物）干净直至没有明显红色血样污染物为止。

1.2.3 样本保存温度为冷冻状态，运输条件为低温运输。

1.2.4 DNA降解情况需要注意，采集样本后需要尽快冷冻运输，避免时间间隔过长，发生DNA降解。

观察并记录培养成功的标本，統计分析标本的绒毛细胞核型，根据绒毛标本是否存在异常核型来进行分组，并用高通量测序技术来分析胚胎停育的染色体异常类型及常见绒毛组织的异常核型的差异。高通量测序：收集新鲜冷冻的流产组织物，取绒毛组织10mg（不少于10mg），从中提取基因组DNA。（1）基因组DNA的片段化：使用超声打断仪，将提取的基因组DNA打断成小片段的核酸。（2）DNA小片段文库构建：用打断后的小片段核酸作为起始模板，构建文库。主要过程：用酶反应法将小片段核酸的5′端突出末端补平，或将3′端突出末端削平后用T4 DNA 连接酶连接在DNA片段两端，回收合适范围的片段。用PCR扩增法富集。再次进行片段选择、纯化。（3）测序：将DNA文库进行测序。使用的仪器：IlluminaHiSeq2500 测序平台。（4）分析：将高通量测序结果通过比对软件将每个测序Reads匹配到其所在的染色体上。随后做相应标准化Z值分析，通过Z 值进行染色体异常判定[3]。

1.3 统计学处理 应用 SPSS 19.0统计学软件分析数据，以（）表示计量资料；比较采用t检验；计数资料采用字检验；以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绒毛组织培养结果：将94例胚胎停育患者的绒毛标本进行长期细胞培养，成功率达100%。其中检出正常核型45例，正常率达47.9%；异常核型49例，异常率达52.1%。

2.2 绒毛细胞异常核型的类型分析：对检出的49例标本进行染色体的异常类型分析：检出常染色体三体的异常率47.06%（16/34），明显高于三倍体20.59%（7/34）、四倍体8.82%（3/34）、嵌合体 8.82%（3/34）、性染色体单体 8.82%（3/34）及结构异常5.88%（2/34）等类型检出率，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

二胎政策开放以来，很多高龄孕妇在患有高血压、糖尿病、瘢痕子宫等情况下受孕，且年龄逐渐增高。相关数据表示，造成胚胎停育的主要因素有感染、免疫、内分泌及遗传等因素，其中遗传因素占最主要因素，约60%以上的胚胎停育患者是胎儿染色体异常所致。遗传因素致使的胚胎停育，不仅造成本次妊娠的不良结局，也对患者今后的妊娠带来不同程度的影响。因此明确胚胎停育的原因对正常妊娠具有重要意义。对下一次妊娠进行有效的科学指导，避免过度使用药物进行备孕。

绒毛组织的染色体结构、物遗传特性、胎儿的染色体结构等基本一致，且绒毛组织的细胞分裂能力强。对采集的绒毛细胞用相应的体外培养手段集取足够的处于分裂中期的绒毛细胞进行分析、研究胚胎的遗传学。

本组研究应用消化培养法获取绒毛细胞染色体的分裂相。应用高通量测序分析绒毛细胞异常核型的构成，提示绒毛细胞异常核型最常见的类型是常染色体三体，且正常遗传物质的异常染色体的主要表现形式：断裂、倒置、移位等的结构异常；单倍体、三倍体及多倍体等的数目异常。胚胎停育染色体主要的绒毛细胞异常核型类型是数目异常，其中常染色体三体异常最为常见。胚胎在受精卵早期卵裂、性细胞成熟的过程中，因多种遗传因素造成染色体异常分离，导致染色体数目异常。染色体数目增多形成数目异常的染色体三体、三倍体等。通过对患者进行多方面的检查明确是否因内分泌、环境、免疫等方面的影响因素导致胚胎停育，进而在下次或以后的妊娠中避免这些影响因素[4]。

本组研究提示，产前进行遗传学细胞核型分析，对保证妊娠安全起重要作用。通过培养绒毛细胞、应用高通量测序技术、分析绒毛细胞核型、判断胚胎染色体是否异常、进一步分析核型的异常类型（重点警惕染色体数目异常，尤其是常染色体三体异常的绒毛细胞），对染色体异常的患者应及时给予干预或终止妊娠，避免发生不良妊娠结局。对于已发生胚胎停育的患者，若检出绒毛细胞异常核型应进行进一步的患者遗传学分析，明确导致绒毛细胞核型即胚胎核型异常的原因，正常绒毛细胞胚胎停育的患者则需通过免疫因素、内分泌因素、环境因素等进行多方面分析，明确导致胚胎停育的非遗传影响因素，进而通过针对性干预措施降低再次妊娠的胚胎停育发生率[5-8]。

4 结论

胚胎停止发育的原因（感染、免疫异常、染色体异常等）复杂。传统的绒毛组织培养，染色体核型分析方法只能检测10Mb以上片段的重复、缺失，无法检测出微小的片段缺失和片段重复，而高通量测序可以检出200kb以上的片段重复和片段缺失。应用高通量测序技术分析绒毛染色体的核型，可以有效的明确患者胚胎停育的原因。

综上所述，结合高通量测序技术有利于对早发现、早预防以及早治疗，对于既往有过胚胎停育史育龄期妇女，应进行相关的检查。尽早筛查、明确病因、避免漏诊，便于及时针对性的采取积极措施，有效减少胚胎停育的发生，对优生优育有重大意义。

参考文献

胡浩梅 . 胚胎停育与染色体异常的相关研究 [D]. 天津：天津医科大学，2014.

杨晨晨，胡小萍 .FISH 检测孕 早期胚胎停育和自然流产绒毛染色体异常的应用研究[J]. 新疆医科大学学报，2015，38（5）：612-614

蔡莉蓉.戚红. 祝建疆.高通量测序技术与传统染色体核型分析技术在稽留流产遗传学分析中的比较， 中国优生与遗传杂志2015，23（1）R394.3

张明，孟和宝力高，郭兰英，等 .9 号染色体臂间倒位1 例 [J]. 中国医学创新，2010，7（35）：115

杨金金 .miRNA-126、Ets-1 和 MMP-9 在胚胎停育绒毛组织中的表达研究 [D]. 长沙：中南大学，2013.

李伟，郝娜，周京，等 . 胚胎停育絨毛染色体培养与分析 [J]. 中国优生与遗传杂志，2010，18（10）：48-50.

徐雪琴，李焕铮，林小玲，等 . 温州地区 110 例早孕胚胎停育绒毛染色体核型分析[J]. 中国优生与遗传杂志，2012，20（12）：54-55.

马玲利，丛林，袁静 .100 例早孕 胚胎停育绒毛染色体核型分析 [J]. 中国妇幼保健，2011，26（26）：4104-4105.