禽流感病毒检测方法研究进展

(海南省动物疫病预防控制中心,海南 海口 570100)

0 引言

1887年，意大利发现首例禽流感，OIE将其划为A类传染病，中国将此病划为一类传染病。禽流感病毒属于正黏病毒科，直径为80～120nm，呈丝状体等形态。囊膜表面有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种纤突。AIV最显著的生物学特征之一是亚型众多，至今已发现A型流感病毒的血凝素(HA)亚型有16种，神经氨酸酶(NA)有10种亚型，通过基因重组形成具有新特征的病毒。各个亚型之间无交叉免疫性，给疫苗免疫造成很大困难，且禽流感一旦暴发往往给养禽业带来毁灭性的打击，高致病性禽流感可以导致动物及人类死亡，因此，建立一种快速、高效的检测方法是快速诊断方法是预防禽流感的重要途径。

1 血清学检测

1.1 血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验

该试验既是WHO进行全球流感监测采用的普及方法,也是我国目前对禽流感感染和免疫的主要检测手段。该方法操作简单、特异性高，但是需要排出NDV等病毒的干扰，不能直接检测出病料中的病毒，并且可能出现假阳性的结果。

1.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

该方法敏感性好,可以检测抗体及抗原,适用于大批血清样品的检测。目前,ELISA检测方法的研究在国内外发展很快,主要集中在诊断介质和诊断试剂的改进以及缩短诊断时间。有学者利用昆虫杆状病毒表达系统制备了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、类病毒脂质体和病毒样颗粒,建立了相应的检测方法。试验表明,利用3种抗原包被所建立的ELISA方法均具有良好的重复性和稳定性,批间和批内变异系数均小于10%,但单独表达的HA蛋白和类病毒脂质体特异性更好,而且类病毒脂质体有更高的免疫反应性,与灭活全病毒相比安全性更高,故在H5N1亚型AIV抗体水平检测方面更具有应用前景。

1.3 电化学发光免疫方法

亓文宝[1]等用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。结果表明所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。

1.4 纳米荧光检测方法

为了实现对禽流感病毒的简便、快速检测，有学者采用纳米荧光标记方法对H9亚型AIV进行研究建立相应检测体系，研发适合H9亚型AIV早期感染现场诊断的纳米荧光检测试剂盒。结果表明:建立的H9亚型AIV纳米荧光检测卡特异性良好，与其他亚型AIV及禽类呼吸道疾病病原无交叉性，灵敏度可达到0.031HA单位，本试验建立的H9亚型AIV纳米荧光检测卡特异和敏感，检测结果准确，可用于H9亚型禽流感的检测。

1.5 胶体金免疫层析法

刘晓燕[2]对HI效价最高单克隆抗体进行纯化,制备了金标抗体玻璃纤维素膜；同时制备了兔抗H7亚型AIV血清并进行纯化,包被再硝酸纤维素膜上,最终制备了胶体金免疫层析试纸条。该试纸条特异性、敏感性及重复性均符合要求,可作为H7亚型禽流感快速诊断的检测试剂。

2 分子生物学诊断方法

2.1 多重PCR

张曼[3]等根据GenBank已登录的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的基因序列合成3对引物，通过优化反应条件,建立了同时鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检验。该方法能快速鉴别3种病毒,敏感性较强,结果显明所建立的AIV、NDV和FAV-4多重PCR检测方法可以用于临床上3种病原的鉴别诊断。

2.2 实时荧光定量PCR

该方法是在DNA扩增反应中，以荧光物质测每次PCR循环产物总量的方法。王晨曦[4]等通过分析NCBI数据库中H7亚型AIV的HA基因序列,设计特异性引物,建立了针对北美H7亚型的实时荧光定量PCR检测方法。该方法灵敏度可达53 Copies/μL。为监测北美H7亚型AIV提供了良好的技术支撑,可用于外来AIV的监测。

2.3 环介导等温扩增技术(LAMP)

该技术具有操作简单、不需要大型仪器设备、成本低廉、反应时间短、结果判定简单等优点,且具有比常规分子生物学方法更高的灵敏度和特异性。有研究针对H5亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因8个保守区域设计了3对扩增引物,添加到RT-LAMP反应体系中,并加入优选的冻干保护剂进行冷冻干燥。结果显示该反应体系可以冻干处理等步骤研制成试剂盒,经验证该方法特异性好、敏感性高、并且操作简捷,适宜在基层兽医实验室以及养殖场推广应用。

3 结语

近些年来禽流感的检测技术有了很大的发展，但每种检测方法都各具优缺点，固定一种检测手段很难满足不同情况的检测，比如在养殖场或疫情爆发地可以用胶体金诊断试纸条进行初筛，这种方法不需要大型仪器、操作简单，且结果判定迅速，而进行确诊的时候就要借助大型仪器(如荧光PCR仪)进行复诊，如有需要可继续按照病毒分离的方法进行确诊。因此，实际工作中应当根据实际情况比较各种检测方法的优劣，选择合适的检测方法。另外，应推动成熟的研发成果商品化，使检测工作结果更加准确快速便捷，促进我国动物医学及畜牧业健康快速持续发展。