PCV2 Cap蛋白的胞内互作蛋白研究进展

陈 艳，颜 秋，刘 畅，吕其壮,2*

(1.玉林师范学院 生物与制药学院，广西 玉林 537000；2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室，广西 玉林 537000)

PCV2作为已知的感染哺乳动物的最小病毒[1]，不仅被确定为断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体[2]，而且能引起猪体继发其他类型疾病的感染，使猪体发病状况呈混合感染趋势，对全球的养猪业造成了巨大的经济损失[3-4]。目前，国内外对PCV2的研究多数集中在PCV2新型基因工程疫苗的研发和PCV2感染的检测方法方面，虽然已研制成功了多种类型的疫苗和先进的诊断方法，然而，在很多国家和地区PCV2依然是困扰养猪业的主要传染病病原体之一。究其原因是人们对PCV2的致病机理还不是十分清楚，尤其是PCV2导致宿主免疫系统抑制的机理、PCV2与宿主细胞的相互关系、PCV2编码的蛋白对PCV2复制和致病性的调控机制、与宿主细胞内蛋白分子之间的相互作用网络等方面的研究内容相对较少。鉴于此，本文对PCV2唯一的结构蛋白Cap的胞内互作蛋白的研究进展进行全面阐述，以期为进一步开展PCV2 Cap蛋白在病毒的复制、运输以及致病性中作用的研究提供依据。

1 Cap蛋白概述

Cap蛋白是PCV2病毒的衣壳蛋白，由位于PCV2单链闭合环状DNA负义链上的ORF2基因编码并由宿主所编码的蛋白酶合成，全长234 aa，分子量约为27.8 kDa[3]。研究表明，Cap蛋白主要定位于宿主细胞核中，其N端的前41个aa是该蛋白的核定位信号(NLS)，其中第12～18位氨基酸残基(R-H-R-P-R-S-H)和第34～41位氨基酸残基(H-R-Y-R-W-R-R-K)对Cap蛋白的核定位起决定性作用[2-3,5]。分子生物学研究表明，Cap蛋白只有一个糖基化位点(143～145 aa)，其N端富含碱性氨基酸和精氨酸且是其主要抗原位点所在区域，这些抗原位点包括3个特异性抗原位点(69～83 aa、117～131 aa和169～183 aa)和3个空间上重叠的抗原位点(47～63 aa、165～200 aa和230～233 aa)[3,6-7]，其中Y-173，F-174，O-175及K-179是抗原识别的重要位点[8]，因此Cap蛋白具有良好的免疫原性[9]。流行病学分析表明，编码Cap蛋白的ORF2基因常被选为主要靶基因用于区别PCV2和PCV1感染的分子标识、PCV2毒株进化分析和PCV2分子流行病学调查，这是因为其拥有较少的labor-extensive序列、较短的基因长度和在PCV2和PCV1之间存在显著的差异[2]。也正是因为这样，Cap蛋白具有多态性，而这种特性又使得Cap蛋白在PCV2病毒的吸附、装配、运输和结构稳定性中发挥重要作用[3,10]。有关PCV2毒力的研究表明，ORF2基因上的1 331～1 339 nt基因序列决定了PCV2病毒复制力及其毒力[11]，且替代PCV2 Cap 蛋白的P110A或R191S位氨基酸能够明显促进PCV2复制[12]，说明Cap蛋白在PCV2病毒复制中起调控作用。最近的研究显示，Cap蛋白单体由7个长短不一的loops结构(Loop BC、Loop CD、Loop DE、Loop EF、Loop FG、Loop GH和Loop HI)和8个富含正电荷氨基酸氮端在内的β-strands构成。其中，位于核衣壳蛋白表面的大部分是loops结构，包裹在核衣壳内部的是β-strands，只有当60个Cap蛋白组装形成Capsid后才可见[13]。

2 Cap蛋白与其他蛋白的作用

PCV2因其结构精简，其复制需要依赖宿主细胞才能完成，这种依赖大多通过其衣壳蛋白Cap与宿主细胞因子相互作用来实现[1]。截止目前，共发现11种蛋白可以与Cap蛋白互作，分别是：2006年，Timmusk等[14]利用细菌双杂交和GST pull-down试验证明，Cap蛋白能与Rep蛋白、补体因子C1QBP、细胞黏附因子P-选择素(P-selectin) 相互作用；2009年，Finsterbusch等[15]利用酵母双杂交和Co-IP试验证明，Cap蛋白能与受体蛋白gC1qR、MKRN1蛋白(makorin ring finger protein 1)、前列腺凋亡反应因子Par-4 (prostate apoptosis response- 4 gene)、核小体组装蛋白NAP1 (nucleosome assembly protein 1)、核磷酸蛋白NPM1 (nucleophosmin，NPM1)和热休克蛋白40 (heat shock protein 40，Hsp40)相互作用；同年，Zhang等[16]利用亚细胞共定位和Co-IP实验证明，Cap蛋白能够与α微管蛋白(α-tubulin)相互作用；2013年，Liu等[17]利用亚细胞共定位和Co-IP实验证明，Cap蛋白能够与热休克蛋白70 (heat shock protein 70, Hsp70)相互作用。

2.1 Cap蛋白与Rep蛋白

PCV基因组进行复制时，需要一种Rep蛋白复合物(Rep和Rep'蛋白)。Rep蛋白含314个氨基酸，而由178个氨基酸构成的Rep'蛋白是由编码Rep蛋白的基因转录剪切而来。据共定位结果显示，Rep蛋白和Rep'蛋白均存在于细胞核内，但由于其结构不同，结合DNA时的部位也不相同[18]。在PCV2复制过程中，病毒DNA被转运至宿主细胞核内合成双链DNA中间体，Rep和Rep'蛋白与双链DNA中间体结合，展开双链DNA结构并暴露出九聚体序列，紧接着Rep和Rep'蛋白识别并切割此序列，并以滚环方式进行基因组复制[18-19]。PCV1感染早期Cap蛋白定位于核仁，Rep蛋白定位于核质，但在感染末期二者均定位于核质，据此推测PCV1通过Cap-Rep互作调控其复制[14]。另有资料显示，PCV2复制过程中其Rep蛋白会结合到Cap蛋白和中间丝蛋白syncoilin上共同参与PCV2的复制，并且在复制的不同时期，Rep和Rep'蛋白的比例不尽相同，但具体在复制周期中哪个阶段发生相互作用及各自的功能和机制，目前尚无定论。

2.2 Cap蛋白与补体因子C1QBP

补体因子C1QBP是补体 C1 酶复合物的亚单位，而补体 C1 酶复合物能够激活补体级联效应，参与宿主细胞防御，在机体固有免疫应答中扮演重要角色[10,14]。通常，C1QBP利用其球头部与抗体(IgG或IgM)结合而激活C1 酶，活化后的C1 酶参与诸多炎症反应。研究表明，PCV2 Cap不仅能够与C1QBP在宿主巨噬细胞的细胞质中相互作用，而且可以通过这种互作抑制C1QBP的泛素化降解过程，结果导致细胞内的C1QBP大量集聚，过量的C1QBP通过PI3K信号转导通路增强宿主巨噬细胞的吞噬能力，进而抑制PCV2的增殖[14,20-21]。

2.3 Cap蛋白与P-选择素

P-选择素是定位于血小板α颗粒和内皮细胞管状小体内，分子量为140 kDa的膜糖蛋白，在细胞受到组织胺等物质刺激、缺氧和损伤等情况下，迅速在质膜上进行表达，参与细胞黏附[14,22]。早在2006年，Timmusk等[14]利用细菌双杂交试验发现Cap蛋白能够与P-选择素相互作用，但直到现在仍未有试验进一步证实这种互作及其蕴含的生物学意义。

2.4 Cap蛋白与受体蛋白gC1qR

gC1qR是补体C1q的受体，在除红细胞外的几乎所有哺乳动物细胞中均有表达，gC1qR与C1q结合，激活细胞免疫，在细胞防御过程中发挥重要作用[10]。如gC1qR能够促进细胞的凋亡，这与其进入细胞线粒体内部进行累积，造成线粒体功能障碍密切相关[23]。研究表明，gC1qR发挥以上功能与其能与多种细胞、病毒和细菌的蛋白结合密不可分[15]。通常，gC1qR与这些蛋白的结合发生在精氨酸簇中，巧合的是Cap蛋白的N 端也富含精氨酸且已被证明能够与gC1qR互作[3,10,15]。更为有趣的是，有文献报道gC1qR能通过与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV) 的Core蛋白相互作用抑制宿主细胞中IL-12的生成[24-25]，而PCV2感染后的外周血单核细胞中IL-12的产量也会明显降低[26]，因此PCV2极有可能通过其Cap蛋白与gC1qR的相互作用来抑制宿主细胞IL-12的表达，而且最近杜谦等关于PCV2对猪肺泡巨噬细胞IL-10、IL-12p40表达的影响及调控机制的研究中也证实了这一推测[27]。最近的研究表明，gC1qR与PCV2a Cap的相互作用比PCV1和PCV2b Cap的相互作用更强。在对该研究中使用的PCV1和PCV2 Cap蛋白的50个N-末端氨基酸进行比对后发现，第30和49位氨基酸可能决定其与gC1qR互作的紧密程度[28]。此外，考虑到Cap蛋白与补体因子C1qBP的相互作用及C1qBP与gC1qR之间的配、受体关系，推测Cap蛋白、C1qBP和gC1qR 三者之间可能会形成三元复合物，但其具体机制和对PCV2复制的影响还有待证实。

2.5 Cap蛋白与MKRN1蛋白

MKRN1基因是MKRN基因家族的根源，存在于多种哺乳动物细胞中，具有多种功能。MKRN1 cDNA全长1 449 bp，可编码一个分子量约为53 kDa且属于E3 泛素连接酶的转录共调节因子，该因子可通过诱导端粒酶亚单位hTERT泛素化和蛋白酶介导的降解来调节端粒酶的活性[29-31]。最近，有关西尼罗河病毒(West Niel Virus，WNV)衣壳蛋白的研究发现，MKRN1在机体感染WNV过程中出现过表达，过量的MKRN1能够诱导WNV Cap蛋白泛素化降解，进而抑制WNV通过其Cap蛋白所诱导的细胞凋亡[32]。有趣的是，Mankertz等[33]发现MKRN1单独表达时呈斑点样聚集于细胞核质区域，而与PCV2 Cap蛋白共表达之后却呈弥散样分布于核质。与此同时，PCV2 Cap蛋白的表达水平也出现显著下降，这些结果表明MKRN1可能会促进PCV2 Cap蛋白的降解。截止目前，这种结论尚处于推测阶段，有关Cap蛋白与MKRN1蛋白互作机制和生物学意义的阐述还需进一步研究。

2.6 Cap蛋白与前列腺凋亡反应因子Par-4

Par-4蛋白是由342个氨基酸组成的分子量约为37 kDa的蛋白，因其首次发现于前列腺癌细胞中，故被命名为前列腺凋亡反应因子，事实上Par-4蛋白具有多种功能，如调节细胞的伸缩和物质运输等[15]。目前，有关Par-4蛋白功能的研究也都集中于其促凋亡作用，且已查明Par-4蛋白是通过其C端的亮氨酸拉链区结合肌动蛋白丝和招募促凋亡蛋白(如DAP样激酶和Amida)到肌动蛋白细胞骨架来促进凋亡[34-35]。尽管如此，PCV2 Cap蛋白与Par-4蛋白互作的发现并未将其与PCV2诱导凋亡的机制联系起来，这是因为有资料显示PCV2诱导的凋亡是由于机体发热造成的，并非由PCV2作用于靶细胞引起。然而，由于PCV2感染早期其病毒样颗粒(viral like particles，VLPs)与细胞表面的黏多糖结合后通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，随后分布于细胞初级内体和溶酶体[15]，而这一过程相当复杂，需要诸多蛋白的参与才能完成，其中就需要一个像Par-4这样的蛋白来招募效应蛋白到肌动蛋白细胞骨架，因此推测PCV2很可能就是通过其Cap蛋白与Par-4蛋白的相互作用将PCV2 VLPs募集至微丝并由此进入细胞核。目前，有关PCV2 Cap蛋白与Par-4蛋白互作的机制和功能还有待证实。

2.7 Cap蛋白与核小体组装蛋白NAP1

NAP1在酵母、动植物中均保守存在，作为分子伴侣与组蛋白等碱性蛋白结合，在胞内运输过程中起作用[15]。研究表明，NAP1通过调节核小体的滑动或更改染色体上组蛋白H2A/H2B来改变染色体的结构，从而调节其代谢水平，进而影响细胞的分化乃至个体发育；通过与细胞周期蛋白互作调控细胞有丝分裂；通过与转录共激活因子p300/CBP 互作调控基因转录；通过与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) Tat、人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV) E2和EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV) NA1蛋白互作促进病毒复制和基因转录[15,33,36]。最近的研究发现，NAP1也能够在蛋白激酶2(CDK2)的调节下进行核质之间的穿梭，这个作用使其能在组蛋白代谢、动植物细胞生长分化及繁殖方面发挥重要功能[37]。因此，推测PCV2 Cap蛋白与NAP1蛋白互作既有可能影响PCV2 VLPs或Cap的运输和装配，又有可能影响PCV2的基因转录，但其在PCV2引起的疾病中所起的作用还需进一步研究。

2.8 Cap蛋白与核磷酸蛋白NPM1

核质蛋白(nucleoprotein，NLP)和核磷蛋白NPM一起统称为 NPM 蛋白家族，该蛋白家族包括NPM1、NPM2、NPM3、NLP四个成员，在核糖体生成、蛋白质运输、中心体复制和作为分子伴侣等方面发挥重要作用[15,38]。研究发现，NPM1蛋白能够诱导诸多蛋白定位于核仁，这些蛋白包括腺病毒(adeno-associated virus，AAV)的Rep68和Cap蛋白、HIV的Rev和Tat蛋白、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus，JEV)的core蛋白以及猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的N蛋白等，而且NPM1蛋白与其互作蛋白的相互作用是由其互作蛋白上的NLS介导[15,33,38]。巧合的是，PCV2 Cap蛋白的N端也有一个NLS，而且该蛋白也已被证实能够与NPM1蛋白互作，因此推测PCV2可能通过其Cap蛋白与NPM1蛋白的相互作用促进病毒衣壳的装配。

2.9 Cap蛋白与Hsp40蛋白

Hsp40蛋白家族广泛存在于多种生物细胞内，这类蛋白都含有四个α螺旋区域：保守的C端、甘氨酸/苯丙氨酸(G/F)富含结构域、锌指结构域及J结构域。Hsp40蛋白参与细胞的多种生命活动，包括细胞应激保护、蛋白质折叠、重折叠或聚集与降解，以及蛋白质移位等方面[39]。最近，不断有研究发现Hsp40能与多种病毒存在相互作用，其中PCV1 最主要的免疫原性蛋白Cap与宿主Hsp40蛋白之间的相互作用关系早在2009年就已见报道，但是PCV2 Cap蛋白是否也能与Hsp40蛋白相互作用以及它们二者之间的这种互作关系所蕴含的生物学意义至今仍然未知[15]。巧合的是，宿主Hsp40蛋白是调控P58IPK活性的关键蛋白，而P58IPK蛋白又是细胞内抑制PKR信号通路的关键蛋白，通常Hsp40与P58IPK以复合体Hsp40-P58IPK的形式存在并处于失活状态，因此许多病毒都会借助于其所编码的病毒蛋白与宿主Hsp40蛋白的互作来拆卸Hsp40-P58IPK复合体而释放P58IPK蛋白，从而实现病毒对宿主PKR效应的抑制并因而促进病毒的复制增殖，如流感病毒(influenza A virus，IAV)就是通过其核蛋白NP与宿主Hsp40互作而促使Hsp40从Hsp40-P58IPK复合体中解离，释放的P58IPK发挥拮抗PKR效应的作用[40]。因此，推测PCV2病毒也极有可能通过其Cap蛋白与宿主Hsp40蛋白的互作来调控宿主PKR信号通路。不仅如此，Hsp40与 MKRN1 类似，还可以参与蛋白酶体介导的蛋白质降解过程，例如Hdj1/ Hsp40可以促进人α-突触核蛋白的泛素化和蛋白酶体介导的降解[41]，故PCV2 Cap蛋白与Hsp40蛋白的互作还有可能促进Cap蛋白的降解。

2.10 Cap蛋白与α-tubulin

α-tubulin可以指球状蛋白质的Tubulin蛋白超家族，也可以是超家族成员蛋白质中的一种。α-tubulin和β-tubulin形成微管蛋白异二聚体是微管装配的基本单位，而微管是真核细胞骨架的主要组成成份之一[42]。微管在许多重要的细胞过程中都有作用，包括有丝分裂，如抑制微管动力学，可以抑制癌细胞的细胞分裂，从而杀死癌细胞。2009年，Misinzo等[43]研究发现，抑制宿主细胞肌动蛋白的聚合能够阻碍PCV2对上皮细胞的感染，提示PCV2可能会利用细胞骨架来帮助其复制和感染靶细胞。2014年，曹晶晶[44]利用激光共聚焦显微镜观察PCV2由细胞外围进入到细胞核的过程发现，PCV2感染第3 h位于细胞边缘而到第15小时病毒蛋白聚集于核内，进一步试验发现重组杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白处理的细胞中α-tubulin乙酰化水平升高，过表达去乙酰化酶抑制剂TSA后PCV2增殖水平明显上升，结果说明α-tubulin的乙酰化可以增强微管的聚合水平和稳定性并因此增加PCV2感染的几率。因此，推测PCV2 可能通过其Cap蛋白与α-tubulin蛋白的互作来促进α-tubulin蛋白的乙酰化，进而促进PCV2复制和其对靶细胞的感染。

2.11 Cap蛋白与Hsp70蛋白

Hsp70与Hsp40同属Hsp家族，Hsp70作用于Hsp40的J结构域，这种互作使得Hsp40参与Hsp70 ATP酶活性的辅助调节过程[45]。最近，Liu等[46]研究发现Hsp70可促进PCV2的复制，但是它作用的具体机制至今尚未明确，考虑到Hsp70是PKR功能的细胞内抑制剂，猜测Hsp70可能通过抑制PKR活性而促进PCV2的复制。此外，由于Cap蛋白既能与Hsp40互作，又能与Hsp70互作，而且Hsp40与Hsp70往往会形成二元复合体，因此Cap蛋白、Hsp70和Hsp40蛋白三者之间能否形成三元复合物以及其在PCV2生命周期中的作用还不清楚。

3 小 结

近年来，PCV2在国内外广泛流行，给养猪行业造成了重创，严重制约着我国乃至全球养猪业的发展。市面上也有多种品牌PCV2商品疫苗，对控制PCV2具有一定的效果，但这些疫苗大多是全病毒灭活性疫苗，其灭活病毒难以纯化，导致PCV2仍在流行。亚单位疫苗和基因工程疫苗虽取得了一定成果，但其遗传安全性备受争议，距大规模市场生产仍有一大段距离。由于PCV2独特的开放阅读框，其Cap蛋白成为疫苗的首选对象，但Cap蛋白与其他蛋白互作的具体机制和功能等仍未研究清楚。因此，进一步研究PCV2 Cap蛋白与宿主蛋白之间的相互作用，将为揭示PCV2致病机理提供理论依据，更为PCVAD的诊断、预防和治疗提供新的策略或治疗靶点。