结核病快速早期诊断技术研究进展

2018-02-14

畜牧兽医科学 2018年5期

（云南省玉溪市江川区动物疫病预防控制中心，玉溪 652600）

1 细菌学检测方法

痰液涂片及痰结核菌培养试验是结核病的主要细菌学检测鉴定方法。除传统罗氏法，目前国内利用氧猝灭荧光原理研发的BACTEC MGIT 960荧光免疫系统可以快速指示培养管中分支杆菌耗氧量与荧光显示的关系，经荧光强度记忆探测器测定，数据经处理后出结果[1]。BACTEC MGIT 960分枝杆菌系统较传统的罗氏法对阳性标本的分离率显著提高，可有效防止病原菌的漏检、误检，其阳性报告时间提前更加明显，但由于该系统试剂的价格昂贵，在临床上推广不现实。

2 免疫学检测方法

2.1 抗原检测

结核分枝杆菌感染机体后，机体内便会产生结核抗原，如何检测出结核抗原便能直接反映感染的存在，因此检测结核抗原具有早期诊断价值[2]。TST是目前常用的结核病细胞免疫学检测方法，通过注射PPD到动物机体后观察注射部位是否产生变态反应作为判断是否感染，但其结果会因个体差异而出现假阳性。而国外有文献记载利用了酶链免疫斑点试验(ELISPOT)可以有较高的灵敏度和特异度的间接检测到结核菌特异性抗原，从而达到了早期快速诊断结核病的目的[3]。ELISPOT是结核病的重要辅助检测技术，该技术可以提高诊断准确率，明确预防性治疗的对象[4]。

2.2 抗体检测

目前，各类免疫色谱卡在结核病早期快速诊断中得以广泛应用，其中，由日本进口的Capilia TB的快速免疫色谱卡效果比较突出，它主要检测的是在结核菌群的培养中分泌到菌体外的蛋白质MPB64，且该蛋白质只在结核分枝杆菌中产生，所以有很强的特异性，高亲和力的抗体流经抗原线时只与特异性抗原结合，因此Capilia TB成为快速准确诊断结核分枝杆菌的技术手段[5]。在20世纪90年代，临床医学主要采用DIGFA诊断结核病，检测所使用的斑点反应板包被有固相结核分支杆菌PPD纯化抗原，痰液中的抗结核分支杆菌抗体(PPD-IgG)会与这种斑点反应板上的抗原形成复合物，该复合物再与SPA或IgG结合，会产生红斑点，该技术简便、快速，适合推广应用于卫生、防疫等部门。蛋白质芯片(Protein Chip,PC)[6]技术作为一种新型高通量的蛋白功能分析技术，蛋白质芯片可以对宿主体内多而复杂抗原谱在表达的数量或种类随个体免疫背景和病程而表现出的抗体谱差异很大情况下筛选药物作用的蛋白靶点对蛋白质表达谱进行分析，并检测多个结核抗体白质，有效提升结核病诊断的阳性率，这在结核病早期快速诊断中有着重要的意义。

3 分子生物学方法

3.1 PCR技术

PCR技术虽然灵敏度高、特异性强，但在临床实际操作中经常呈现假阳性、假阴性、污染等状况，因此像逆转录PCR、nPCR、Real-time PCR等改进后更准确及高灵敏度的诊断技术应运而生。Real-time PCR利用TaqMan荧光探针在扩增时插入一对结核分枝杆菌复合群的特异性引物和一条结核分枝杆菌特异性荧光双标记探针，该探针为一寡核苷酸，两头各标记一个报告荧光基团(Fam)和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，通过检测荧光信号的强弱计算PCR产物[7]。由于Real-time PCR技术检测阳性的意义仅仅提示标本含有结核分枝杆菌核酸，因此结合浓缩涂片法可以直观的看见细菌，对Real-time PCR阳性的病例进行确认，可有效提高特异性，具备快速、精确、耗时短等优点，可推广用于结核病的初期诊断、快速筛查。

3.2 DNA指纹技术

DNA指纹技术是通过特异性核酸探针与结核杆菌基因组杂交后利用内切酶酶切片段，经电泳得到特异性的谱带。国内有学者采取IS6110限制性片断长度多态性(IS6110．RFLP)、寡核苷酸分型(Spoh-gotyping)及多位点可变数目串联重复序列解析(MLVA)3种分型对40株结核分枝杆分别独立解析，并对3种分型方式的结果举行了对比，结果为：采取IS6110-RFLP手艺可以将40株菌分成35种基因型，此中33株结核分枝杆菌具备特异的基因型，占82.5%(33/40)。其余7株只有2种基因型，占17.5%(7/40)，全部都是IS61 10单菌株。这说明该方法在菌株级别对单拷贝的IS6110的菌株的鉴定效果不佳。采取Spoligotyping分型方式可以将40株菌分成17种基因型，此中11株具备特异的基因型，对7株IS6110单拷贝的菌株可以分为6个基因型。而采取MLVA分型方式可以将40株菌分成34种基因型，各型的VN-TR指纹图谱各异，呈现出显著的基因多态性。有29株结核分枝杆菌具备特异的基因型，占72.5%(29/40)。剩余11株菌表现出7种基因型，占27.5%(11/40)。这表明，Spoligotyping分型方式在菌株级别鉴定时的精准度低于IS6110-RFLP和MLVA。而如果将这3种方法结合起来对结核分枝杆菌进行鉴定，其效果显著高于这3方法各自单独利用时的效果，40株结核分枝杆菌可以分成39种基因型，只有2株菌没有分离。因此，可将MLVA方法作为结核分枝杆菌的一线分型方法，Spoligotyping技术作为补充，而IS6110．RFLP作为二线的分型方法[8]。从而克服结核杆菌在分型、追踪和寻觅传染源、内源性复发和外源性再感染或重感染中传统研究的局限性，具有重要的早期快速诊断意义。

4 分子杂交技术

分子杂交是由单链核酸与探针按照碱基配对手段经同位素、生物素等标识后进行鉴别。利用DNA探针杂交检测分支杆菌，可直接在硝酸纤维膜上点样，用结核杆菌DNA探针进行杂交，具有较高的特异性，同时用酶呈色观察结果，使杂交信号得以放大同时提高了菌型鉴定的敏感性，缩短了检测时间[9]。近年来杂交技术对耐药分支杆菌进行分型的研究较为成熟，其中发夹DNA探针就是一种新型结核病初期快速诊断的方法。它利用核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(FRET)规律构建的茎环布局DNA探针，对耐药结核菌单碱基检测具备很强的灵敏性和特异性。相关研究结果表明结核分枝杆菌对链霉素等氨基糖甙类药物的耐药性主要是由白核糖体卵白S12编码基因rpsL和16sRNA编码基因rrs的突变引起的，而发夹DNA探针检测耐药性便是操纵结核分枝杆菌耐药性与基因突变有关机制，检测其与耐药性相干的突变位点，判定结核分枝杆菌的耐药性，该技术对单个碱基的错配、缺失或插入突变具备较高的检出率，不失为一种快速精准的诊断方法。