外泌体在心血管疾病诊疗中的研究进展

刘辉 综述 王国干 审校

(中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外医院心血管疾病国家重点实验室，北京 100037)

外泌体(exosome)是一种由细胞分泌到细胞外的磷脂双分子层囊泡状小体，内含多种蛋白、脂类、信使核糖核酸/微小核糖核酸(mRNAs/miRNAs)等，参与细胞间通讯、免疫调节以及细胞信号通路调节等过程，从而发挥重要作用[1]。来源于不同细胞的外泌体其组成成分及功能不同，可作为疾病诊断的生物标志物。此外，外泌体的脂质双分子层结构，使其成为一种理想的靶向给药载体。心血管疾病已经成为危害人类健康的头号杀手，发现一种新型的治疗方式迫在眉睫，外泌体在心血管病领域的研究受到广泛关注。

1 外泌体与细胞外囊泡

1.1 细胞外囊泡

细胞外囊泡是由细胞分泌的膜性颗粒，为一组异质性较大的亚细胞成分，包括胆固醇、鞘磷脂及磷脂酰丝氨酸等在内的多种脂质成分，并富含核酸及蛋白质，几乎所有细胞均可分泌细胞外囊泡[2]。细胞外囊泡的发现可以追溯到1946年,Chargaff等[3]在31 000 g的条件下离心血浆，发现一种可以加速血栓形成的微粒。细胞外囊泡第一次被报道是在1967年，Wolf[4]通过透射电子显微镜发现一种由血小板分泌的微粒，当时命名为“platelet dust”。最初大家认为，细胞外囊泡是细胞用来清除代谢废物的垃圾桶。近年来，细胞外囊泡的生物学功能引起了学者的广泛关注。随着研究的深入，几乎在所有的体液(如血液、尿液、唾液、脑脊液等)中均可检测到细胞外囊泡。细胞外囊泡是细胞间物质信号交换的一种重要方式，参与细胞增殖、分化及死亡等众多病理生理过程[5]。根据细胞外囊泡的分子大小、生物来源及释放方式的不同，将细胞外囊泡分为3个亚组：(1)来源自多泡小体胞吞融合的外泌体，直径约为30～100 nm；(2)直接从细胞膜通过出芽方式产生的微囊泡，直径约为100～1 000 nm；(3)细胞凋亡或细胞程序性死亡产生的凋亡小体，直径约为1 000～4 000 nm[6]。

1.2 外泌体

外泌体的形成首先是细胞膜内陷形成初级核内体(endosomes)，然后核内体膜进一步内陷形成多个腔内囊泡，即为次级核内体或多泡小体，多泡小体经过溶酶体途径后与细胞膜融合，以胞吐的方式分泌到细胞外即为外泌体[7]。外泌体这种特殊的形成方式使其特征性的高表达膜蛋白四分子交联家族成员如CD81、CD82、CD63、CD9等，及其他类型的蛋白如细胞内源性蛋白质Alix、细胞质蛋白Annexins、热休克蛋白(Hsp90、Hsp70、Hsp60)等。此外，越来越多的证据发现外泌体富含脂质(包括胆固醇、鞘磷脂及神经酰胺等)和核酸(包括DNA、mRNA、miRNA 以及lncRNA等)。细胞处于不同的病理生理条件下，其分泌的外泌体所包含的内容物不同，因此外泌体可以反映细胞的状态，这表明外泌体可能成为疾病诊断及预后评估的生物标志物。外泌体既可以作用于临近细胞，亦可通过体液循环作用于远距细胞。外泌体对靶细胞的作用主要通过3种方式：(1)与靶细胞膜融合进入细胞内释放内容物；(2)受体-配体相互作用；(3)靶细胞通过内吞作用摄入外泌体。外泌体的脂质双分子层结构及上述特性可能使其成为靶向给药的理想载体[8]。

2 不同细胞来源的外泌体在心血管病治疗中的作用

近年来，干细胞治疗心血管病被给予很高的期望，并取得一定的进展。虽然移植干细胞在损伤心肌区域可以分化为血管内皮细胞、血管平滑肌细胞，形成微血管，以及分化为心肌细胞，从而起到治疗效果；但是移植干细胞低的心肌归巢和分化无法完全解释治疗获益，随后的研究发现，干细胞治疗获益主要通过激活自身心肌干细胞、诱导血管新生、保护存活心肌以及抗炎抗纤维化等间接机制改善心功能。这些过程受移植干细胞产生的多种旁分泌因子、小分子、蛋白及mRNAs/miRNAs调控。干细胞分泌的外泌体可以有效转运mRNAs/miRNAs和蛋白质，被认为在调控组织再生方面发挥重要作用[9]。不同干细胞分泌的外泌体具有不同生物学特点，因此可能产生不同的治疗效果。包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSCs)及心脏祖细胞(cardiac progenitor cells,CPCs)在内的多种干细胞来源的外泌体被认为在心血管病的治疗中有广泛的前景。

2.1 ESCs和iPSCs来源的外泌体

ESCs可以分化为成人机体的任何类型的细胞，在再生医学中具有重要的地位。与ESCs类似，iPSCs也具有分化为机体任何类型细胞的能力。二者虽然有强大的分化能力，但由于存在伦理、在心脏中低的归巢和存活率以及定向分化差等原因，在心血管疾病中的应用受限，而二者分泌的外泌体不存在这些问题。iPSCs来源的外泌体也被发现可以促进血管新生、对损伤心肌存在保护作用[10-11]。Khan等[12]发现来源于小鼠ESCs的外泌体通过促进血管新生及心肌存活改善了急性心肌梗死小鼠的心功能。并发现miRNA-294可以促进CPCs存活和增殖。包括miRNA-294在内的miRNA-290家族的miRNA广泛存在于ESCs来源的外泌体中。miRNA-291、miRNA-294及miRNA-295参与调节细胞增殖、分化以及细胞周期。此外，在iPSCs来源的外泌体中发现含有miRNA-21和miRNA-210[10]，二者具有抗细胞凋亡、促进血管新生、调节炎症反应的作用，这表明iPSCs来源的外泌体可以通过富含的miRNA起到保护损伤心肌的作用。

2.2 MSCs来源的外泌体

MSCs存在于如骨髓、脐血、皮下脂肪、骨骼肌等多种组织器官中的一种具有多能分化能力的干细胞。可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞等。包括骨髓来源的MSCs在内的多种MSCs已经被广泛应用于急性心肌梗死与心力衰竭的治疗中。随着研究的深入，人们发现移植到心脏的MSCs并没有表现出强大的分化能力，通过静脉注射的MSCs很少到达心脏，通过冠状动脉注射的MSCs在梗死区域无法长期存活。这表明MSCs改善心脏功能是通过其旁分泌因子而不是直接分化为心脏细胞而起作用的。本课题组之前的研究也发现人脐血MSCs条件培养基可以抑制H9C2细胞凋亡[13]，也证实了这一点。因此，MSCs来源的外泌体作为转运心脏保护因子的媒介引起了广泛的关注。Lai等[14]发现，由ESCs分化而来的MSCs分泌的外泌体可以减少缺血再灌注损伤小鼠心肌梗死面积、改善心脏功能。并发现MSCs来源的外泌体可以减少氧化应激，激活蛋白激酶B(Akt)和糖原合成酶激酶-3，抑制c-Jun氨基末端激酶，同时还有抗炎症反应的作用。MSCs来源的外泌体还被发现富含miRNA-19、miRNA-21、miRNA-22，抑制凋亡、促进血管新生，减少梗死面积，改善心脏功能[15-17]。

2.3 HSCs来源的外泌体

HSCs具有高度自我更新能力，可分化为各类血细胞的祖细胞。同其他细胞一样，HSCs也可以分泌包括外泌体在内的细胞外囊泡，HSCs分泌的细胞外囊泡主要被分泌到骨髓中，也可以渗透入外周血液循环中[18]。HSCs来源的外泌体参与细胞间通讯，被认为可以成为反映骨髓环境的生物标志物，并具有预防和治疗包括心血管病在内的多种疾病的潜力。有研究表明，心肌内注射骨髓来源的细胞可以改善心肌梗死小鼠的心室功能，而这一保护效应无法用直接分化为心肌细胞解释，而可能是通过旁分泌途径激活心脏内源性的祖细胞实现的[19]。CD34是HSCs的主要标志物，CD34+细胞来源的外泌体比其他细胞富含更多的miRNA-126，而miRNA-126具有促进血管新生的作用[20]。然而，目前只有一些间接证据表明HSCs来源的外泌体具有心脏保护作用，尚缺乏直接证据。

2.4 CPCs来源的外泌体

根据生物标志物和形态的不同，CPCs可分为Sca1+、c-kit+、心肌球源性干细胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)以及心肌球(cardiospheres，CSPs)。由于CPCs来源于心脏本身，可以激活内源性修复机制，相比于其他干细胞具有更强的心脏再生潜能。包括动物模型和临床在内的多个研究表明，CPCs注射可以改善梗死心肌的心脏功能[21-22]，并且心肌细胞和血管数量均明显增加。然而，同其他干细胞一样，在心肌中的移植成活率很低，这表明CPCs也是通过旁分泌效应发挥心脏保护作用的。CPCs来源的外泌体含有多种蛋白、生长因子、mRNA以及miRNA等。研究表明，通过注射CPCs来源的外泌体可以减少心肌细胞死亡，改善心肌梗死小鼠的心脏功能[21,23]。进一步研究表明，CPCs来源的外泌体富含miRNA-21、miRNA-132、miRNA-146a以及miRNA-210，通过调节下游的目的蛋白程序性细胞死亡因子4、促红细胞生成素肝细胞受体配体A3和蛋白酪氨酸磷酸酶1B等，从而抑制心肌细胞凋亡，促进内皮细胞迁移[21,24]。

3 外泌体作为生物标志物在心血管病诊断中的作用

由于在不同生理病理条件下，外泌体的数量及内容物可以发生改变，并且外泌体在血液、尿液、唾液等体液中均可检测到。因此外泌体及其包含的脂质、核酸、蛋白质等可以用于帮助心血管病的诊断。Kuwabara等[25]对比了急性冠脉综合征的患者与正常人血清中miRNA-1和miRNA-133a的水平，发现急性冠脉综合征患者血清中的miRNA-1和miRNA-133a较正常人明显升高，而miRNA-133a可以通过外泌体进入血液循环。心力衰竭患者中特异的外泌体miRNA差异性改变使其有帮助诊断心力衰竭的潜力。Matsumoto等[26]分析了377例心肌梗死后心力衰竭患者血清中miRNA的水平，发现心力衰竭患者血清外泌体中P53途径相关的miRNA，如miRNA-192、miRNA-194及miRNA-34a的表达明显升高，他们认为外泌体中的miRNA-192、miRNA-194及miRNA-34a可以被视为心肌梗死后心力衰竭的预测因子。循环中外泌体miRNA也被认为可能成为与心血管疾病密切相关的代谢综合征的新型生物标志物。Karolina等[27]研究发现，代谢综合征患者循环中miRNA-17、miRNA-197、miRNA-509-5p、 miRNA-92a以及miRNA-320a的水平明显增高。其中2型糖尿病的患者仅有miRNA-320a的水平升高。而高血压患者miRNA-197、miRNA-92a水平升高，miRNA-17、miRNA-509-5p及miRNA-320a水平降低。这表明循环中特异的miRNA改变可以反映代谢综合征不同的病理状态。

除miRNA外，外泌体中包含的蛋白也被认为具有心血管疾病的预测作用。大量研究表明，缺氧条件下，外泌体中蛋白的水平明显改变[28]，而缺氧是冠心病的基本病理过程。Cheowet等分析了心肌梗死与稳定型心绞痛患者的血浆细胞外囊泡蛋白的情况，发现两组患者252种细胞外囊泡蛋白存在差异，其中与心肌梗死进程密切相关的蛋白如补体成分1q子成分A、补体C5、载脂蛋白D、载脂蛋白C-Ⅲ、血小板糖蛋白1b α链、血小板碱性蛋白在心肌梗死组明显升高[29]。这预示外泌体蛋白有可能成为诊断心肌梗死的生物标志物。

目前，外泌体作为生物标志物在心血管病中的研究尚少，但随着研究的深入，相信其在临床诊断心血管病中的应用具有广阔的前景。

4 展望

随着药物和手术治疗的不断发展，心血管病的治疗已经取得很大的进展。然而，心血管病患者的远期预后和生存率仍不理想。干细胞移植治疗心血管病的有效性已在大量的基础及临床研究中得到证实，但是仍存在免疫排斥、伦理、移植细胞在损伤心肌生存率低等问题。起初人们认为，干细胞可以分化为心肌细胞、促进心肌的修复和再生，然而随后的研究发现只有很少的心肌细胞来自移植细胞的分化，于是旁分泌机制被发现并引起学者的重视。外泌体被认为是一种新颖的并且具有巨大潜力的治疗心血管病的方法。虽然外泌体的研究尚处于起步阶段，仍存在许多问题需要解决，如目前的外泌体的提取方法无法得到高纯度、高浓度的外泌体，仍存在一定的免疫排斥反应，远期的有效性及安全性尚不明确。然而，外泌体包含多种脂质、核酸及蛋白，在细胞间通讯中扮演着重要的角色，在心血管病的生理病理过程中发挥着重要作用，这预示着外泌体广阔的治疗前景。外泌体存在于所有的体液中，不同生理病理条件下，外泌体的数量及内容物会发生改变，稳定的脂质双分子层结构可以保护内容物免受破坏，这些特点使其具有成为生物标志物的潜力，可以更早更准确地反映疾病的进程。随着研究的不断深入，上述问题得到解决，相信外泌体可以成为治疗心血管疾病的有力武器，而在这之前，还需要做大量的基础及临床研究。