紫花苜蓿细胞质雄性不育系和保持系SCAR标记的鉴定研究

周 仂， 王英哲， 谭 晶， 徐安凯，， 徐 博*

(1. 吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林 长春 130118； 2. 吉林省农业科学院， 吉林 长春 130118)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是起源于伊朗的一种优良牧草，也是我国种植面积最大的人工牧草。紫花苜蓿具有很强的杂种优势，为利用好杂种优势，需建立一套准确、高效的授粉控制系统，而雄性不育是紫花苜蓿利用杂种优势的重要途径之一。近年来，紫花苜蓿雄性不育机理也受到越来越多国内外学者的关注[1-4]。20世纪80年代，Kaul统计并发现雄性不育分为细胞核不育(Genic Male Sterility)和细胞质不育(Cytoplasmic Male Sterility)，细胞质不育也称质-核互作雄性不育[5]。细胞核不育虽然由单基因调控，但是无法得到保持系，所以在生产应用中具有局限性。细胞质不育的不育性虽然是由不育的细胞质基因和相对应的核基因共同决定，但相比细胞核不育它可以找到保持系，适应于“三系”配套，在实际生产应用上有广阔的前景[6]。Robins J G等利用转基因手段获得了紫花苜蓿雄性不育株，揭示了其不育性的细胞学机理，并进一步对其进行了相应的遗传分析[7]。由于紫花苜蓿不育系和保持系在形态上无明显差异，故无法通过形态学鉴定法在田间将二者区别开来，近年来随着科学技术的快速发展，分子标记技术在紫花苜蓿不育机理研究中扮演着关键的角色。

近年来，简单重复序列区域(Inter Simple Sequence Repeat，ISSR)分子标记技术已经被广泛应用于植物的功能基因定位，遗传多样性分析等方面。ISSR标记技术由Zietkiewicz等人于1994年所建立[8]，能产生丰富的多态性位点来揭示种间及种内的遗传差异[9]，操作简单、快速、重复性好，属显性标记，适合于系统学[10]、遗传多样性[11-12]、品种鉴定[13]、构建遗传图谱[14-15]等研究。吴安迪等对在西南地区收集到105份材料进行了核型分析和ISSR分析，筛选出了5条引物，结果显示相同地理区域的材料在聚类分析中多聚为一类[16]。

随着现代研究手段的进步和理论研究的补充，AFLP、RAPD、RFLP、ISSR等分子标记技术都被应用于杂交种纯度鉴定研究中[17-20]，但这些分子标记技术都存在不同的缺点。因此常将这些标记转化为SCAR[21]、STS[22]等标记。1993年Paran和Michelmore发明并应用SCAR标记技术(Sequence Characterized Amplified Region)[23]。SCAR标记即特异序列扩增区，是以RAPD、RAGP、RFLP等分子标记为基础对目标多态性DNA片段进行克隆和测序，设计一段长为20 bp～24 bp的引物，再PCR扩增。相比较RAPD、RGAP等标记，SCAR标记操作更简单并且提高了分子标记的重复性与稳定性。王晓武等用RAPD标记与BSA法结合研究获得与甘蓝显性雄性不育基因Ms连锁的1个RAPD标记OT11900，并转化为稳定的SCAR标记，为甘蓝显性雄性不育基因的辅助选择提供了理论基础[24]。陈沁滨等运用RAPD技术对洋葱雄性不育系101A和同型保持系101B的基因组DNA进行研究分析，得到1个和洋葱细胞质雄性不育基因连锁的特异片段AK151400，并将其成功转化为SCAR标记，为不育基因分子标记辅助选择育种体系的建立奠定了基础[25]。

尽管目前紫花苜蓿不育系的相关研究较多，但在紫花苜蓿细胞质不育机理的研究方面仍存在一些问题。本研究中通过已获得紫花苜蓿细胞质雄性不育系材料和保持系材料，筛选与紫花苜蓿细胞质不育恢复基因高度连锁的分子标记，并转化SCAR标记，对方便快捷鉴定不育系种子纯度提供研究基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料 在紫花苜蓿雄性不育系材料MS-GN-1A及其保持系材料MS-GN-1B回交四代后选育出优良的不育系及其保持系材料，取自吉林农业大学试验田。将组配好的植物材料置于30℃下培养紫花苜蓿黄化苗7天，取样品鲜样1 g并提取各单株的植物线粒体DNA，构建紫花苜蓿不育系和保持系混合基因池，用于其多态性分析。利用不育系材料MS-GN-1A与保持系材料MS-GN-1B筛选培育出新的4组紫花苜蓿杂交种的不育系母本和同型保持系父本MS-JN-1A，MS-JN-1B，MS-JN-2A，MS-JN-2B，MS-JN-3A，MS-JN-3B，MS-JN-4A，MS-JN-4B用于SCAR标记的鉴定分析。

1.1.2引物 本试验所用的100条ISSR引物为加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套引物，由上海生工有限公司负责合成。

1.1.3试剂 采购由北京康为世纪生物公司生产编号为CW2619的质粒提取试剂盒、2 × EsTaq酶;编号为EG101-2的DNA回收试剂盒、pEASYT1载体购自北京全试金生物公司。

1.2 方法

1.2.1提取线粒体和基因组 DNA在30℃下培养紫花苜蓿黄花苗7 d，取样品鲜样1 g根据试剂盒的提示提取线粒体DNA并用浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测所提取的DNA质量。

1.2.2ISSR-PCR扩增 本试验所用的ISSR引物为加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套引物，由上海生工有限公司负责合成。经过我们之前的实验结果，选择针对紫花苜蓿线粒体DNA多态性好的引物，进行PCR扩增，使用20 μl体系，其中包括模板DNA 60 ng、dNTPs 0.4 mmol·L-1、引物0.6 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶 1.5 U和10×PCR Buffer 2 μL。扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。反应产物在1.5 %琼脂糖凝胶100 V电压下电泳约2 h，在凝胶成像仪上拍照并保存。

1.2.3紫花苜蓿不育系和保持系特异片段的克隆及测序 按照凝胶回收试剂盒的步骤进行多态性位点的切胶回收工作，回收的片段经检测无误后，连接到pEASY-T1克隆载体上，按照pEASY-T1 Cloning Kit说明书连接并转化Trans1-T1感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆。将阳性重组子培养后用质粒提取试剂盒提取并鉴定。之后将阳性重组子的质粒送上海生工进行序列测定，并通过NCBI数据库进行比对分析。

1.2.4SCAR紫花苜蓿不育系和保持系 SCAR标记的引物设计及扩增检测根据多态性片段的测序结果，设计PCR特异性引物，引物由上海生工有限责任公司合成，将ISSR-PCR特异性片段转化为SCAR标记。根据设计引物的Tm值，确定其退火温度。扩增程序为：94℃ 预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸5min；4℃ 保存。以4对不育系和保持系线粒体基因组DNA为模板，用已设计的SCAR标记进行PCR扩增。反应结束后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍摄照片并保存。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿线粒体DNA的提取与分析

根据上述提取DNA的方法提取紫花苜蓿的线粒体DNA，通过共8份材料提取得到线粒体DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA质量。结果如图1所示，条带整齐，颜色清澈透亮，提取的线粒体DNA满足试验要求用于ISSR-PCR扩增。

图1 线粒体DNA电泳检测Fig.1 Genomic DNA Electrophoresis Detection

2.2 紫花苜蓿不育系和保持系线粒体DNA的ISSR多态性分析

以本实验之前优化的ISSR反应体系与筛选的引物为基础进行ISSR分析，在图2中可以看出，引物842和引物864的扩增图谱中，保持系分别比不育系多出1条特异性片段，经反复验证，其差异条带均稳定出现，条带大小都在500 bp左右。可以初步判断，这2个特异性片段都只在保持系中出现，表明这2个片段可能与紫花苜蓿的细胞质不育基因相关。

图2 不育系及与持系线粒体DNA部分ISSR引物筛选图Fig.2 Mitochondrial DNA of sterile line and maintainerline screened by ISSR primers注：M：DNA标准；A：不育系；B：保持系Note:M:DNA Marker;A:sterile line;B:maintainer line

2.3 紫花苜蓿ISSR特异性条带的测序和序列分析

将差异片段切胶并回收，连接转化至大肠杆菌中，挑取阳性克隆摇菌并抽提质粒，经过M13F/R引物进行鉴定，其结果显示，2个特异性片段均已成功连接至pEASY-T1载体上，可用于后续进行测序分析使用。

测序结果显示2个片段的大小为457 bp和645 bp，将这2个序列利用NCBI数据库的Blastn程序进行分析发现，这2个序列存在于紫花苜蓿的线粒体DNA中，不编码任何已知功能蛋白，但可用于不育系和保持系的鉴定和杂交种筛选。

2.4 SCAR标记的转化及鉴定

根据测序结果获得的序列，设计一对特异性引物SCAR842-F(5’-GAGAGCCAAGCATCATTGATGGCG-3’)，SCAR842-R(5’-AGAGCTTGAGGGGTGGTGACCAT-3’)和SCAR864-F(5’-ATGATGGTGTAGTCAGGTTCAGTT-3’)，SCA R864-R(5’-ATGATGAACCGCTTACTCAACA-AGAA-3’)(图3)。这2对特异性SCAR标记在所有4个保持系中均稳定扩增出1条特异性条带，大小均与目的片段相同(图4，图5)。表明已经将ISSR-PCR分析中的多态性位点转化为稳定的SCAR标记，可用于后续检测和鉴定不育系和同型保持系和不育系种子的纯度。

图3 特异性片段序列信息Fig.3 The Sequence of Different DNA Bands

3 讨论

在种类繁多的分子标记中，SCAR标记由于其优越的稳定、简便、快速等性能脱颖而出，目前成为了分子标记在辅助选择育种、种子纯度分析等育种实践中能直接应用的首选标记。[26]。周生茂等通过集群分离分析法(BSA)与相关序列扩增多态性技术(SRAP)获得与苦瓜抗白粉病高度相关的SRAP标记EM20ME5并转化成为SCAR标记SCRA-EM20ME5，该标记可用于苦瓜抗白粉病的分子标记辅助选择[27]。张春宝等通过ISSR标记方法获得大豆不育系与相应保持系间的特异片段ISSR829,并将其转为SCAR标记，可用于今后大豆不育系的筛选和不育系种子纯度鉴定[28]。王仁汉等在已获得洋葱雄性不育基因连锁的SCAR标记OC2175的基础上，对10份已知育性的洋葱(5份不育系，5份保持系)和20份未知育性的洋葱进行提取DNA并PCR扩增，发现SCAR标记OC2175可以区分洋葱的不育系与保持系，初步验证了该标记可用作于洋葱雄性不育系材料的分子标记辅助选择[29]。Shu-Fen Li等在麦芽秆和麝香草种鉴定出17个雄性特异性扩增片段，后经BLAST技术分析得到7种与反转录转座子高度相关的连锁序列并将其中2个转化为SCAR-E52M11，SCAR-E54M11-2标记，结果显示这2个标记可以有效地用于鉴定葎草的遗传性、为进一步研究性染色体的进化提供研究基础[30]。亚秀秀等将前人测序的11个与青海芥菜型油菜多室基因连锁的AFLP标记转化为SCAR标记，其中AFLP组合SA09MG08和SA10MC16被成功转化，多态性良好，可利用该SCAR标记对青海芥菜型油菜苗期多室与二室鉴定，显著提高了育种效率[31]。毕波等运用ISSR，AFLP和SRAP等技术对4个不同遗传背景的紫花苜蓿进行褐斑病抗性的适用性验证，验证结果显示适用性高的标记为感病标记ISSR22S450、抗病标记SRAPM3E3R169和ISSR20R750;适用性中等的标记有感病标记ISSR6S640和AFLP38S264,抗病标记AFLP1R206,AFLP16R185和ISSR834R450;适用性差的标记有感病标记ISSR11S750和ISSR22S640[32]。已有研究表明，SCAR标记在基因定位和分子标记辅助育种中已经开始普及，但在种子纯度分析和不育系种子纯度鉴定上却鲜有报道，在紫花苜蓿中尚未见相关研究。

图4 SCAR842对4对不育系和保持系进行PCR检测电泳图Fig.4 Four pairs of male sterile lines and maintainerlines detected by SCAR842注：样量：50 μL；浓度：50 ng·μL-1；M：DNA标准；1A～4A：新培育的4个保持系材料；1B～4B：新培育的4个不育系材料Note:Sample amount:50 μL;Concentration:50 ng·μL-1;M:DNA Marker; 1A～4A:4 newly maintained lineage materials;1B～4B:4 newly cultivated CMS materials

细胞质雄性不育是指由细胞质不育基因与细胞核不育基因共同调控的一种不育类型。大量研究表明，细胞质雄性不育与线粒体基因组紧密相关，相比较而言与叶绿体基因组关系疏间[33]。利用ISSR分子标记技术，发现引物842和引物864的扩增图谱中保持系分别比不育系多出1条特异性片段，经比对发现序列存在于紫花苜蓿线粒体基因上。推断可能由于这2个序列在紫花苜蓿细胞质雄性不育系中缺失，而与其对应的保持系线粒体基因组中该片段正常，但是否此片段缺失造成不育系花粉败育仍不能确定。

图5 SCAR864对4对不育系和保持系进行PCR检测电泳图Fig.5 Four pairs of male sterile lines and maintainerlines detected by SCAR864注：样量：50 μL；浓度：50 ng·μL-1；M：DNA标准；1A～4A：新培育的4个保持系材料；1B～4B：新培育的4个不育系材料Note:Sample amount:50 μL;Concentration:50 ng·μL-1;M:DNA Marker;1A～4A:4 newly maintained lineage materials;1B～4B:4 newly cultivated CMS materials

4 结论

本研究用100条ISSR引物进行筛选，结果显示UBC842、UBS864引物在紫花苜蓿不育系及其同型保持系显示出稳定特异性条带，条带大小分别为457 bp和645 bp。将特异性条带克隆测序后转化为SCAR特异鉴定标记，并对4对紫花苜蓿杂交种的不育系母本和同型保持系父本进行鉴定分析，发现该标记的重复性好，而且稳定，表明该标记可以作为紫花苜蓿不育系种子纯度分析的候选标记，实际应用于紫花苜蓿不育系种子纯度的鉴定，并且随着紫花苜蓿参考基因组信息的补充，本研究中筛选出鉴定的SCAR标记在紫花苜蓿雄性不育机理的研究中将会发挥越发重要的作用。