Hedgehog信号通路与多发性骨髓瘤耐药性的评述*

刘志强，柳 静

1 HH信号通路的组成和活化机制

在哺乳动物中，HH信号通路的核心元件是包括3个配体 sonic hedgehog（SHH）、desert hedgehog（DHH）和Indian hedgehog（IHH）、1个12次跨膜的膜受体Patched1（PTCH1）、1个像G蛋白耦联受体的7次跨膜蛋白smoothened（SMO）和3个转录因子glioma-associated oncogene homolog 1（GLI1）、glioma-associated oncogene homolog 2（GLI2）和 glioma-associated oncogene homolog 3（GLI3）[1]。

纤毛是细胞膜上的突出结构，由微管支撑，HH信号通路的主要元件皆与它密切相关。它为这些信号通路中的分子提供了特定的区域，对其分布和功能极其关键。纤毛可能还有其他的作用，其中信号通路各分子的浓度可以调控对信号的反应，而纤毛细胞器本身也具有特殊的固有调节。例如，最近有研究表明，纤毛中有一个脂质膜成分对纤毛的功能和HH信号通路十分重要[2]。

当没有HH配体时，PTCH1定位在纤毛上，对纤毛上积累的SMO起抑制作用，这是哺乳动物激活信号通路不可避免的一步。PTCH1在纤毛上发挥着关键的作用，一个强有力的证据就是PTCH1可以抑制SMO的活性，其对SMO的抑制作用是通过纤毛上PTCH胞内不同长度截短的尾巴调整其强度[3]。当与HH配体结合时，PTCH1离开纤毛，从而解除了对SMO的抑制作用，允许SMO易位到纤毛中。对于纤毛上PTCH1的离开和SMO的进入之间的关系以及信号通路的激活至今仍是一个谜。在进入纤毛之前，SMO与Discs Large Homolog 5（DLG5）在基底部结合，这一步对随后信号通路的激活十分重要[4]。在纤毛中，SMO与Ellis-van Creveld syndrome protein（EVC）和EVC2形成复合体传导HH信号[5]。SMO的激活触发胞内的信号级联传导，从而促进了转录因子GLI在纤毛的转运及加工处理，调控其转录活性[6]。

哺乳动物的3个GLI蛋白含有共同的DNA结合结构域，包括5个串联的C2H2锌指结构和一个C端激活结构域，只有GLI2和GLI3包含N端阻遏物结构域[7]。GLI1编码一个前馈通路的激活因子用于对通路激活作出响应，Gli1的转录完全取决于HH信号通路的激活[8]。GLI2和GLI3可形成全长的激活因子或截短的抑制形式[9]。GLI的直接功能是决定细胞的命运，是组织形态的控制、细胞增殖和细胞存活调节器，HH信号通路的不同元件也在正/负反馈调节中发挥作用[8]。

大量的研究发现HH信号通路中与GLI调控相关的蛋白质。哺乳动物GLI蛋白的两个核心调控蛋白是 suppressor of fused（SUFU）和 kin-esin family member 7（KIF7）。在细胞质中，SUFU通过对三个GLI蛋白的阻滞从而对哺乳动物HH信号通路起负调控作用，在核内SUFU也能与GLI2反应抑制GLI2的活性[10]。KIF7是一种驱动蛋白，在纤毛的顺行性传输（从基部到顶端）中起作用[11]。在从基部到顶端过程中有一系列激酶调控GLI的磷酸化，包括protein kinase A（PKA）、casein kinase I（CK1）、glycogen synthase kinase 3β（GSK3β）12。GLI2和 GLI3被PKA、CK1、GSK3β磷酸化，然后被蛋白酶体加工处理形成各自的阻遏形式GLI2R和GLI3R[12]。在这种情况下，定位于纤毛基部的G蛋白偶联受体GPR161上调cAMP，激活了PKA活性[13]。一旦信号活化，KIF移动到纤毛的顶部促进GLI2和GLI3的激活，抵制SUFU的活性，cAMP的水平因GPR161离开纤毛和PDE4的降解作用而下调，PKA的活性也因其下调而受限制[14]。综上所述，从SUFU解离出来的GLI2和GLI3形成了激活的GLI2和GLI3（GLI2A和GLI3A），转移到核内并激活它们的靶基因。在经典HH信号通路中，大多数GLI依赖的HH靶基因的激活都是受GLI2A调控的[15]。

2 Hedgehog信号通路在造血系统中的作用

在胚胎造血中，Hh信号通路随时间和环境而改变。小鼠研究表明，IHH在早期的血生成和血管生成的激活过程中发挥关键作用。IHH和SMO缺失都与“血岛”分化和功能血管重建的抑制有关[16]。相反，在替代实验条件下，IHH缺乏没有损害早期的红细胞生成、造血干细胞(haematopoietic stem cell，HSC)或祖细胞形成[17]。反而晚期红细胞生成有缺陷，常常导致致命性妊娠中期贫血。在哺乳动物胚胎中出现多功能HSCs的第一个确定位点被称为主动脉-性腺-中肾区(aorta-gonad-mesonephros，AGM)区域。Gering和Patient提出，至少在斑马鱼胚胎中，Hh通路抑制环巴胺在早期造血过程中，使SMO稳定在非活性状态下，导致HSC血生成缺陷[18]。此外，Zhao等在SMO敲除小鼠模型中发现，HSC在二次移植中出现长期的功能性缺陷，表明SMO在HSC功能中起着重要的作用[19]。在小鼠造血细胞中，条件性缺失PTCH1未能诱导Hh通路的功能上调，且无表型效应[20]。相反，在骨髓微环境中缺失PTCH1，增加了c-kit+/Sca-1+阴性细胞，髓样祖细胞的动员，以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的凋亡。因此，PTCH1的缺失导致了不同细胞外机制的造血作用，细胞循环增加，而不是直接激活造血细胞中的Hh信号通路。这些研究强调了Hh通路抑制药物对造血直接和间接作用的重要性。

为了探讨GLI家族成员在正常造血过程中的重要性，研究通路远端的SMO和PTCH1，Merchant等发现在Gli1敲除的小鼠模型中的HSC和祖细胞分布位置是不同的。与野生型小鼠相比，Gli1敲除小鼠增加了长期的HSC，缺陷的HSC和祖细胞增殖，降低了骨髓分化。此外，Gli1敲除的HSCs的细胞周期蛋白D1表达减少，极有可能导致增殖减弱。总体而言，Hh信号在正常的造血过程中发挥了重要的调节作用[21]。然而，与这些结果形成鲜明对比的是，其他实验系统使用增益和功能损失条件的SMO基因模型表明，Hh通路活性实际上对HSC的维持和功能是可有可无的。Dierks等指出，当胎鼠肝脏的SMO/HSCs(妊娠14～5 d)移植到C57BL/6小鼠时，未出现明显的再生能力缺陷。然而，明显的是CD8+T细胞几乎完全丧失，强调了Hh信号通道对淋巴细胞发育的重要性[22]。其他的工作也证明，条件性SMO缺失或过度激活对成人HSC的功能和自我更新无显著影响。在SMO缺陷小鼠中，SMO缺失对HSCs的相对频率或绝对数量均无影响。如果是这样的话，至少在成人造血稳定时期时，这可能会增加恶性生理造血的治疗空窗期。这明显地对比了Zhao等人所描述的关于SMO缺陷小鼠的研究结果，尽管使用了不同的实验方法。在Zhao的实验方法中，虽然SMO缺陷小鼠的HSCs和分化细胞的频率与对照组比较无变化，但在原发性和继发性移植的HSC长期功能上存在明显的缺陷[19]。

3 HH信号通路与多发性骨髓瘤药

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种浆细胞来源的恶性血液系统肿瘤，起源于骨髓中的浆细胞，属于一种B淋巴细胞淋巴瘤。目前WHO将其归为B细胞淋巴瘤的一种，其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链（M蛋白）过度生成[23]。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害、细菌性感染等并发症。西方国家发病率估计为2～3/10万，我国的发病率为～1.5/10万，男女比例为1.6︰1，大多患者年龄＞40岁[24]。目前，MM的治疗主要靠药物化疗，但是常规化疗效果差，预后不良，而肿瘤多药耐药性（multi-drug resistance，MDR）则是MM化疗失败的关键因素。人恶性肿瘤对化疗的耐药性可分为先天性耐药和获得性耐药。大量研究表明，HH信号通路在肿瘤耐药性形成过程中发挥重要作用。HH的活化根据其机制不同，分为经典型活化通路和非经典型活化通路。其中经典型活化指的是通过配体，即SHH、IHH、或者DHH与受体PTHC结合之后，激活GLI转录因子而发生的HH信号通路活化；而非经典型活化指的是不依赖于配体的活化方式，通常包括受体的突变、细胞浆或者细胞核内其他因子对GLI1、GLI2等转录因子的持续活化性修饰而导致的异常活化[25]。无论是配体依赖型还是非依赖型，肿瘤发生过程的一个关键驱动因素是因其过度活化。Munshi实验室的研究发现经典和非经典的Hedgehog信号通路的激活在MM肿瘤发生中都发挥了重要的作用[26]。Lennon实验室对MM病人样本进行GLI3、SHH、PTCH1和p53基因突变的测序发现，发现9%的MM患者体内存在GLIPR1/GLIPR1L1/GLIPR1L2三个缺失突变的位点，因为GLI3是一种抑制性的转录因子，因此GLI3的突变造成了HH信号通路的过度活化，这也是非经典HH信号通路活化的一种方式[27]。

我们实验室之前的研究发现，经典型和非经典型Hedgehog信号通路的活化，都能诱导MM细胞产生耐药性。在多发性骨髓瘤病人的骨髓中，骨髓瘤细胞能自分泌产生SHH，通过与PTCH1受体结合激活HH通路，促进下游抗凋亡基因BCL2的表达，抑制化疗药物马法兰、硼替佐米等诱导的细胞凋亡，从而产生肿瘤耐药[28]。Derick等的研究也发现，骨髓间充质干细胞分泌的SHH因子，也可以通过旁分泌的方式，激活HH通路，促进多发性骨髓瘤细胞的增值和化疗药物引起的耐药性[29]。另外，我们还发现，发性骨髓瘤细胞内异常活化的MAPK-ERK通路，能够通过MEK1抑制GSK3b的水平，从而抑制对GLI2的泛素化降解，造成GLI2过度积累从而造成HH通路的过度活化，促进其下游的BCL2的转录调控表达，从而促进MM细胞产生耐药性[30]。

随着对MM耐药性产生的研究进展，发现一些microRNA是通过调控Hedgehog通路来实现的。Tang等人的研究发现，miR-324-5p在多发性骨髓瘤病人体内是低表达的，但是SMO和GLI1都是高表达的，尤其是17p染色体缺失突变的病人，这是因为miR-324基因跟HH的基因都定位于同一条染色体上。功能学的研究也发现，miR-324-5p可以抑制MM细胞的增值、抗凋亡和肿瘤细胞的干性[31]。Xu等的研究发现，miR-1271在MM的初发病人和MM细胞系中都是低表达的，而且过表达miR-1271将抑制MM细胞的增值，并且能促进凋亡。机制研究发现，miR-1271是通过直接负调控SMO受体实现的[32]。这些研究的结果，为未来开发逆转MM耐药性提供了靶点的参考。

Hedgehog信号通路也可能是通过促进MM肿瘤干细胞而达到促进肿瘤产生耐药性的。Peacock CD等的研究表明，在MM细胞，有一群比较少的侧群细胞，其表面标志物为CD19+CD138-的为分化细胞，具有特别高表达的HH通路活性[33]。另外有研究发现，在复发性多发性骨髓瘤的病人MM细胞中，RARα2受体比初发病人显著增高，而且跟预后呈现负相关。实际上，高表达的RARα2是在MM肿瘤干细胞内，其主要的作用有以下几点：①促进肿瘤的耐药性；②增强其克隆形成能力；③激活Wnt和Hedgehog信号通路；④增加侧群细胞的数量和醛脱氢酶的活力；⑤上调胚胎干细胞的基因表达[34]。由此可见，无论是HH自身直接活化，还是通过其他通路诱发的非经典通路活化，都可以通过维持MM肿瘤干细胞。因为肿瘤干细胞也是肿瘤产生耐药性的一种重要机制，因此Hedgehog信号通路可能是通过维持MM细胞的中路干细胞干性，从而产生耐药性。

4 小结与展望

HH抑制剂已成为治疗多种肿瘤的有效手段，但HH通路还没有被人们完全了解。结合目前的研究进展，揭示在体内更深层次的调控机制有利于我们针对HH通路依赖型肿瘤，包括多发性骨髓瘤，研发更有成效的肿瘤治疗策略。在治疗上，HH通路是一个重要的肿瘤治疗和再生医学靶点。虽然在成体阶段静息状态的HH通路被激活对各种器官再生发挥重要作用，但并没有利用HH通路这些有利方面的临床报道。而且，一开始人们把研究集中在HH通路在促肿瘤发生的破坏性作用上，HH最突出的作用就是刺激和促进癌症发生，这也使得人们在进行再生治疗时应更加谨慎。

对于提高对HH通路依赖型肿瘤的治疗策略还有很大的探索空间，目前，vismodegib和sonidegib作为SMO抑制剂，都应用到对SMO的临床治疗，也可以对晚期和转移性BCC进行治疗。通过对MM患者的研究，寻找鉴定区分患者响应的方法能够帮助更好的设计和解释临床试验。

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