斑马鱼模型用于药物抗肿瘤活性筛选的研究进展

徐 硕，姜文清，邝咏梅，徐文峰，金鹏飞

(北京医院药学部，国家老年医学中心，药物临床风险与个体化应用评价北京市重点实验室，北京 100730)

斑马鱼(zebrafish)又名蓝条鱼、花条鱼和斑马担尼鱼等，是一种热带观赏鱼，体长4～6 cm，属鲤科短担尼尔属，原产于印度、孟加拉。自1994年冷泉港集会以及Nature和Science等杂志发表专题评述，到2009年斑马鱼全基因组测序完成，斑马鱼已成为一种公认的新型模式生物。

与线虫、果蝇和鼠等其他模式生物相比，斑马鱼与人的器官在结构、生理和分子水平等方面相似性极高，和人类的基因组保守性很高，在蛋白质水平上，关键部位的同源性几乎是100%。国内外利用斑马鱼及其突变体已建立了多种人类疾病模型[1-3]，并开展了相关的药物筛选评价研究工作。

从肿瘤生物学角度来看，斑马鱼和人的肿瘤在组织学上非常相似；两者肿瘤均具有遗传性；人和斑马鱼的基因序列相比较，二者在细胞周期基因、肿瘤抑制基因和癌基因等方面均具有保守性。斑马鱼的胚胎特征与肿瘤相似，具有细胞分裂速度快、细胞凋亡速度延缓和血管生成能力旺盛等特点。本文对近年来斑马鱼模型在抗肿瘤活性筛选中的应用研究进行综述。

1 抗肿瘤活性研究中斑马鱼模型的类型

1.1化学诱导致癌模型 Beckwith L G等[4]通过利用乙基亚硝基脲(ENU)处理，致使斑马鱼患皮肤癌，在大于1 mm的肿瘤里可观察到血管新生。Lam S H等[5]对人及斑马鱼肝脏肿瘤的 microarray数据进行比较，发现导致癌症发生的基因是保守的。常用致癌物亚硝基胍(MNNG)和9，10-二甲基-1，2-苯并蒽(DMBA)易导致斑马鱼胚胎肿瘤的发生[5-7]。

1.2基因突变模型 相比于野生型斑马鱼，抑癌基因失活的斑马鱼肿瘤发病率较高。Tp53是十分重要的抑癌基因，50%以上的肿瘤患者体内会发生该基因的突变[8]。Berghmans S等[9]利用靶向选择性突变技术，建立了一个在Tp53的DNA结合结构域存在错配突变的斑马鱼突变体。纯合的Tp53突变体在8.5个月出现神经鞘肿瘤，另一个肿瘤抑制基因是结肠腺瘤息肉基因(APC)，为Wnt通路的重要组分[10]。因为APC发生突变常导致结肠肿瘤患者的Wnt通路被异常激活。Hurlstone A F L等[11]在筛选ENU突变的斑马鱼时发现了一个APC突变体，受精后96 h，纯合的APC突变体死亡。杂合的APC突变体在胚胎期发育正常，但15个月后，肠道、肝脏和胰腺肿瘤发生于大多数胚胎[12]，并伴有高表达Wnt靶基因以及β-catenin 的累积，这些特征与人结肠肿瘤具有一致性。

1.3基因组改造模型 特定基因的活性上调而导致的肿瘤很适合采用转基因斑马鱼进行研究。通过构建由斑马鱼rag2启动子驱动小鼠c-myc与GFP的融合基因(zRag2-EGFP-mMyc)，或是单独的小鼠c-myc基因(zRag2-mMyc)的转基因品系，能使人T淋巴细胞白血病(T-ALL)的发病过程得到模拟[13]。zRag2-EGFP-mMyc的平均潜伏期是52 d。zRag2-mMyc 的平均潜伏期是44 d。在潜伏期之后，白血病由胸腺部位逐渐蔓延至腮弓、眼球后软组织、骨骼肌及腹部组织。表达GFP的白血病细胞在移植后，依然能导致接受过放射的斑马鱼患上T-ALL。对该T-ALL模型做进一步改造，利用Cre-loxp系统使c-myc的表达得到控制[14]。

1.4移植模型 采用肿瘤细胞移植的方法能够建立某些肿瘤的斑马鱼模型。崔戈等[15]分别构建BAMBI过表达稳转结肠癌细胞株SW620(BAMBI+组)、空载体红色荧光蛋白基因转染结肠癌细胞株SW620(EV组)，分别显微注射到受精后第2天转基因斑马鱼Tg(Apo14∶GFP)胚胎卵黄囊，激光共聚焦荧光显微镜观察，用ImageJ软件测量转移至斑马鱼肝脏内结肠癌细胞的红色荧光表达强度。结果表明，相比于EV组，激光共聚焦荧光显微观察显示BAMBI+组斑马鱼肝内结肠癌细胞红色荧光表达量显著增加；BAMBI+组斑马鱼肝转移发生率也明显增加。构建的基因修饰人结肠癌细胞移植斑马鱼致肝转移模型，可较好地模拟活体状态的结肠癌肝转移；BAMBI基因能促进异种移植入斑马鱼的结肠癌细胞发生肝转移。

刘军秀等[16]利用线性化的红色荧光质粒pcDNA3.0+DsRed转染人宫颈癌SiHa 细胞，通过显微注射法将稳定表达红色荧光的SiHa细胞移植入48 hpf(发育后时数)的FLK转基因斑马鱼胚胎内，建立了人宫颈癌斑马鱼模型。结果显示注射不同数量人宫颈癌SiHa细胞能不同程度地影响斑马鱼卵，产生最佳促进血管新生作用的是注射50～100个细胞。注射Matrigel的对照组斑马鱼，在注射后的第1和第2天突出到肠下静脉血管篮外到卵黄的垂直分枝平均血管数频率分别为2.8%±1.4%和5.4%±2.2%。而注射SiHa细胞的斑马鱼新生血管数明显高于对照组，在注射后第1和第2天突出到肠下静脉血管篮外到卵黄的垂直分枝平均血管数频率分别为8.0%±2.7%和27.4%±3.2%。

2 斑马鱼模型在抗肿瘤活性成分筛选中的应用

2.1在天然产物或中药活性筛选中的应用 大量研究显示，多种肿瘤(包括实体瘤和血液肿瘤)的生成、转移、复发和预后都与肿瘤血管生成密切相关。夏小艳等[17]采用斑马鱼模型，测定靛玉红的抑制血管生成活性。结果表明，质量浓度为10和50 mg·L-1可明显抑制斑马鱼胚胎体节间血管生成，抑制率为20.9%。

杨大松等[18]从土党参(金钱豹Campanumoeajavanica的根)90%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分离得到14个化合物，采用斑马鱼胚胎模型对其抗血管生成活性进行评价。结果显示，4E，8E，12E-三烯-10-炔-1，6，7-十四烷三醇(3)和9-(2-四氢吡喃)-8E-烯-4，6-二炔-3-壬醇(4)在质量浓度为50 μg·mL-1时对斑马鱼节间血流具有明显的抑制作用，化合物3与4抗斑马鱼血管生成的EC50分别为136.38和68.70 μg·mL-1。

林风等[19]对海洋小单胞菌产生的缩肽类化合物rakicidins的体内外抗肿瘤活性进行了研究。结果显示，Rakicidin B1、A和B对人结肠癌(HCT-8)细胞的增殖具有明显的抑制作用，在乏氧培养条件下的抑制作用更强，与在常氧条件下相比，分别为各自的15，26和14倍。利用移植人结肠癌HCT-8肿瘤斑马鱼模型，测试了体内抗肿瘤活性，化合物B和B1可明显抑制肿瘤生长。王荣春等[20]通过将SiHa细胞注入48 hpf的斑马鱼胚胎卵黄囊，建立斑马鱼移植瘤模型，采用细胞增殖实验(MTT)测定芦荟大黄素(AE)在不同质量浓度下对人宫颈癌细胞SiHa生长的抑制作用。结果表明，AE质量浓度为1.0和0.5 μg·mL-1时可抑制斑马鱼移植瘤的增殖和转移，MTT法显示，AE对SiHa细胞的生长具有明显抑制作用，表现出一定的质量浓度-时间-效应依赖关系。

黄志军等[21]在斑马鱼卵黄囊内植入荧光标记的人乳腺癌(MCF-7)细胞，建立了移植瘤模型，采用该模型探讨小金胶囊(麝香、木鳖子、制草乌和枫香脂等10味中药组成)的抗肿瘤作用，对新生血管形成的抑制作用的观察是利用转基因斑马鱼。结果显示，小金胶囊在质量浓度为26.47，88.24和264.72 μg·mL-1时对斑马鱼MCF-7移植瘤的抑制率分别为31.66%，54.35%和53.77%，在质量浓度为264.72 μg·mL-1时可明显抑制血管形成和诱导细胞凋亡，抑制率和诱导率分别是21.74% 和28.92%。

韩利文等[22]以TG(VEGFR2∶GFP)系血管荧光转基因斑马鱼和AB系斑马鱼为模型，分别用单体成分靛玉红、虎杖提取物、长春花提取物和西黄丸处理斑马鱼胚胎，考察对斑马鱼胚胎血管生成的影响。结果显示，靛玉红在质量浓度为50 μg·mL-1时能显著抑制斑马鱼节间血管的生成；虎杖、长春花乙酸乙酯提取物分别在质量浓度为10和100 μg·mL-1对斑马鱼血管生成具有明显抑制作用；西黄丸溶液质量浓度为100 μg·mL-1时抑制血管生成作用与对照组相比具有显著差异。

2.2在化学药物筛选中的应用 吕文文等[23]采用斑马鱼模型，考察了化合物的体内抗肿瘤血管生成活性。结果N-苄基-4，6-二甲氧基邻苯二甲酰亚胺和N-苄基-4，6-二羟基邻苯二甲酰亚胺可明显抑制人肺腺癌A549细胞中血管内皮生长因子的分泌，并对斑马鱼体节间血管的生成有明显抑制作用。

于歌等[24]用不同质量浓度盐酸多西环素(Dox)对斑马鱼胚胎进行处理，诱导其肝脏异常增生，利用毒性作用及综合评价诱导效应，用来确定适合的诱导质量浓度，对索拉非尼抑制肝部异常增生的能力进行研究。结果表明，Dox的最适诱导质量浓度是60 mg·L-1，索拉非尼能明显抑制斑马鱼模型的肝部异常增生。

2.3在中西药联用抗肿瘤中的应用 薛迪等[25]采用的实验模型为24 hpf(hour post fertilization，hpf)健康TG(VEGFR2∶GFP)系血管荧光转基因斑马鱼，分别用复方苦参注射液、顺铂及其两药合用处理24 h，以节间血管作为检测指标，用SPSS软件对实验数据做统计分析。结果显示，顺铂质量浓度为50和100 μg·mL-1时对节间血管有明显的抑制作用，质量浓度为5 000 μg·mL-1的复方苦参注射液抑制节间血管作用明显，两药合用时比单用具有更明显的抑制效果。

3 讨论

斑马鱼与人类基因组学的相似度达到87%，心血管、神经和代谢系统的解剖结构、生理、分子生理学特征与哺乳动物相似性高，是一种理想的动物模型，运用斑马鱼能进行大规模药物筛选。该模型能避免细胞和化学筛选模型的局限性，从整体水平直观地评估药物的治疗作用、不良反应和毒性作用等。有报道近期美国科学家成功培育出一种透明斑马鱼，人们能够直视这种斑马鱼的内部器官，实时观测活体器官中的肿瘤以及其他各类肿瘤的生长过程，这类新培育出的斑马鱼会在整个生命过程中保持透明状态[26]。斑马鱼生物模式可作为一个系统的生物学应用于药物开发，也可将斑马鱼发育毒理或实验模型用于化合物的毒性筛选中[27-28]。

斑马鱼在新药发现的应用有一定局限性，如目前仍缺少能够重现人类疾病机制的斑马鱼模型。对于中药药效物质基础的研究是发现新药的重要途径之一，通过对有效成分的结构改造，有可能发现更多高效低毒的先导化合物[29]。利用斑马鱼作为药物筛选模型尚处于发展阶段，但已显示出巨大的潜力。相信在科学家们的共同努力下，斑马鱼模型在药物抗肿瘤活性筛选中的应用研究会越来越深入，将发现更多新的活性化合物，对这些活性成分的研究也会不断加深人们对生命现象的认识。

参考文献：

[1] Langheinrich U.Zebrafish：a new model on the pharmaceutical catwalk[J].Bioessays，2003，25(9)：904-912.

[2] Cross L M，Cook M A，Lin S，et al.Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(5)：911-915.

[3] Liu S，Leach S D.Zebrafish models for cancer[J].Annu Rev Pathol，2011，(6)：71-93.

[4] Beckwith L G，Moore J L，Tsao-Wu G S，et al.Ethylnitrosourea induces neoplasia in zebrafish (Daniorerio) [J].Lab Invest，2000，80(3)：379-385.

[5] Lam S H，Wu Y L，Vega V B，et al.Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression[J].Nat Biotechnol，2006，24(1)：73-75.

[6] SpitsbergenJ M，Tsai H W，Reddy A，et al.Neoplasia in zebrafish (Daniorerio) treated withN-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine by three exposure routes at different developmental stages[J].Toxicol Pathol，2000，28(5)：716-725.

[7] Spitsbergen J M，Tsai H W，Reddy A，et al.Neoplasia in zebrafish (Daniorerio) treated with 7，12-dimethylbenz[a]anthracene by two exposure routes at different developmental stages[J].Toxicol Pathol，2000，28(5)：705-715.

[8] Beroud C，Soussi T.The UMD-p53 database：new mutations and analysis tools[J].Human Mutat，2003，21(3)：176-181.

[9] Berghmans S，Murphey R D，Wienholds E，et al.Tp53 mutant zebrafish develop malignant peripheral nerve sheath tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(2)：407-412.

[10]Logan C Y，Nusse R.The Wnt signaling pathway in development and disease[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2004，(20):781-810.

[11]Hurlstone A F L，Haramis A P G，Wienholds E，et al.The Wnt/β-catenin pathway regulates cardiac valve formation[J].Nature，2003，425(6958)：633-637.

[12]Haramis A P，Hurlstone A，van der Velden Y，et al.Adenomatous polyposis coli-deficient zebrafish are susceptible to digestive tract neoplasia[J].EMBO Rep，2006，7(4)：444-449.

[13]Langenau D M，Traver D，Ferrando A A，et al.Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish[J].Science，2003，299(5608)：887-890.

[14]Langenau D M，Feng H，Berghmans S，et al.Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(17)：6068-6073.

[15]崔戈，谢珊珊，张婷，等.BAMBI基因过表达人结肠癌细胞移植斑马鱼致肝转移模型的构建[J].中华临床医师杂志：电子版，2015，9(21)：3939-3945.

[16]刘军秀，夏梦，何勉，等.宫颈癌细胞促进血管新生斑马鱼模型的建立[J].中山大学学报：医学科学版，2015，36(3)：456-460.

[17]夏小艳，刘可春，王思锋，等.大青叶中靛玉红的抗血管生成活性研究[J].中国药学杂志，2010，45(3)：187-189.

[18]杨大松，李资磊，王雪，等.土党参的化学成分及其抗血管生成活性研究[J].中草药，2015，46(4)：470-475.

[19]林风，陈晓明，周剑，等.海洋小单孢菌产生的缩肽类化合物rakicidins抗肿瘤活性研究[J].中国抗生素杂志，2016，41(7)：516-519，523.

[20]王荣春，韩利文，陈锡强，等.利用斑马鱼模型研究芦荟大黄素对宫颈癌细胞SiHa的抑制作用[J].山东科学，2016，29(2)：14-18.

[21]黄志军，兰小红，赵刚，等.小金胶囊对斑马鱼移植瘤的抗肿瘤作用[J].中成药，2016，38(9)：1902-1906.

[22]韩利文，袁延强，何秋霞，等.斑马鱼模型在中药活性筛选中的适用性研究[J].中草药，2011，42(10)：2037-2041.

[23]吕文文，孙迎东，姜宏，等.新型N-取代邻苯二甲酰亚胺类衍生物抗肿瘤血管生成活性评价[J].药学研究，2016，35(10)：583-586.

[24]于歌，赵倩，刘云章，等.转基因斑马鱼模型应用于索拉非尼抗肝癌活性筛选的方法研究[J].中国海洋药物，2017，36(1)：48-54.

[25]薛迪，韩利文，何秋霞，等.复方苦参注射液联合顺铂对斑马鱼血管生成的协同作用[J].时珍国医国药，2015，26(7)：1585-1587.

[26]谢菲，陈晗，李建明，等.斑马鱼在肿瘤研究中的应用[J].中国热带医学，2009，9(6)：1161-1164.

[27]Mushtaq M Y，Verpoorte R，Kim H K.Zebrafish as a model for systems biology[J].Biotechnol Genet Eng Rev，2013，29(2)：187-205.

[28]Ball J S，Stedman D B，Hillegass J M，et al.Fishing for teratogens：a consortium effort for a harmonized zebrafish developmental toxicology assay[J].Toxicol Sci，2014，139(1)：210-219.

[29]姚佳慧，王义仁，周楠，等.Mcl-1小分子抑制剂在肿瘤治疗中的应用进展[J].西北药学杂志，2016，31(5)：547-552.