DRD3基因rs6280位点多态性与图雷特综合征表型的关联分析*

图雷特综合征(Tourette Syndrome, TS)是一种以多种运动抽动和一种或多种发声抽动为特征的神经发育性障碍，抽动症状可能同时出现也可能在疾病的不同时段先后出现，具有突发、快速、无目的、不可自控的特点且复杂多变[1]。TS病因和发病机制迄今不明，目前认为TS是遗传因素与环境因素相互作用的结果，遗传因素在TS的病因中起着重要作用，且TS为多基因作用的复杂疾病。神经影像学、药理学及分子遗传学等的证据表明TS与多巴胺系统缺陷相关[2]。国内外学者进行了大量的探讨，但研究结果可重复性较差[3]。DRD3主要分布在与认知和情感等功能相关的脑区，DRD3受体在中脑边缘多巴胺系统高表达，包括由纹状核、中央杏仁核和NAc壳部组成的“扩展的杏仁核系统(extended amygdala) ”。DRD3基因Ser9Gly(rs6280)多态性影响D3受体的亲和力，导致受体蛋白中甘氨酸替代丝氨酸。DRD3基因rs6280位点多态性已广泛应用于神经精神疾病的遗传病因学研究，迄今已有大量研究对其不同易感位点与精神疾病的相关性进行了探讨[4]。本研究主要探讨DRD3基因rs6280位点多态性与TS表型的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 受试者为2009年12月～2015年12月就诊于首都医科大学附属北京安定医院儿科门诊及住院的TS患者以及招募的正常儿童青少年，使用自制的临床信息调查表进行基本资料的收集。由1位儿童精神科副主任或以上医师按照美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM-IV)诊断标准进行诊断和临床分型。

1.1.1 TS患者共同入组标准 (1)符合DSM-IV中TS诊断标准；(2)年龄6～18岁；(3)无其他中枢神经系统疾病及严重躯体疾病；(4)汉族；(5)性别不限；(6)家族史阴性；(7)能完成所有测查；(8)患者及监护人知情同意。入组全部TS患者160例，其中男128例，女32例，男∶女为4∶1；平均年龄(11.62±3.32)岁，根据是否有共患病及共患病情况进行临床分型，结果如下：(1)单纯TS患者组：共入组43例，符合TS患者共同入组标准，排除注意缺陷多动障碍(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)、强迫性障碍(Obsessive Compulsive Disorder，OCD)等共患病情况，无其他共患病情况；(2)TS+ADHD患者组：共入组47例，符合TS患者共同入组标准，同时符合DSM-IV中ADHD诊断标准，不符合DSM-IV中OCD诊断标准，无其他共患病情况；(3)TS+OCD患者组：共入组37例，符合TS患者共同入组标准，同时符合DSM-IV中OCD诊断标准，不符合DSM-IV中ADHD诊断标准，无其他共患病情况；(4)TS+ADHD+OCD患者组：共入组33例，符合TS患者共同入组标准，同时符合DSM-IV中ADHD及OCD诊断标准，无其他共患病情况。

1.1.2 正常对照受试者入组标准 (1)健康儿童；(2)年龄6～18岁；(3)无中枢神经系统疾病、严重躯体疾病及物质滥用依赖等；(4)无精神疾病且家族中无精神疾病及自杀者；(5)汉族，无血缘关系，且与TS患者亦无血缘关系；(6)性别比例与全部TS组接近；(7)能完成所有测查；(8)受试者及监护人知情同意。共纳入90名受试者进入对照组，其中男73名，女17名，男∶女为4.3∶1；平均年龄(11.42±2.37)岁。

本研究报首都医科大学附属北京安定医院医学伦理委员会审批，在取得正式批准并获得患者及家属签署知情同意后开展。所有受试者均对本次研究知情，受试者<7岁由监护人签署知情同意书，受试者≥7岁由患者及监护人共同签署知情同意书。全部TS患者性别(χ2=0.263，P=1.012)、年龄(F=1.836，P=0.231)与对照组比较，差异均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 收集晨空腹外周血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用全血基因组DNA提取试剂盒(PROMEGA,美国)的离心柱法提取基因组DNA。全部DNA样本均经浓度以及纯度检测。

1.2.2 单核苷酸多态性(SNP)的挑选 通过美国国立生物信息情报中心检索dbSNP (Datebase of Single Nuleotide Polymorphisms, dbSNP)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)，国际人类基因组单体型图(HapMap)计划(http://www.hapmap.org/)提供的汉族人群遗传学数据及以往文献报道[5,6]为依据，选取DRD3的SNP位点rs6280进行基因多态性分析。

1.2.3 基因分型 采用TaqMan探针SNP基因分型技术进行DRD3 SNP位点rs6280的分型,引物和探针由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc, ABI)定制,PCR反应试剂TaqMan Universal PCR MasterMix 亦由ABI公司提供。PCR反应体系为5μL,包括模板10 ng,2×TaqMan PCRMasterMix 2.5 μL,20×SNPAssay(包括引物和FAM /VIC探针)0.25 μL。反应条件为95℃10 min；(92℃15 s, 60℃1 min)×40个循环。PCR反应和荧光信号读取均在ABI7900HT SequenceDetector(384孔板)上完成,以SDS2.4图像分析软件Allelic Discrimination程序进行终点分析,通过检测不同等位基因所标的FAM和VIC荧光强度,判断各待测样本基因型为野生纯合子、突变纯合子还是杂合子。

1.2.4 统计学方法 使用SPSS17.0软件包进行资料的数据分析，基因型频率和等位基因频率使用百分率[n(%)]表示，使用Hardy-Weinberg平衡法则进行基因型及等位基因吻合度检验，应用χ2检验，比较各病例组及对照组基因多态性差异是否有统计学意义，检验水准为α=0.05。多组之间两两比较的χ2检验中，若与对照组比较，检验水准为α=0.05/(n-1)；所有组间两两比较，检验水准为α=0.05×2/n(n-1)。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验结果 DRD3基因SNP位点rs6280基因型频率在对照组(χ2=3.195，P=0.074)和全部TS组(χ2=0.302，P=0.582)，均达到Hardy-Weinberg平衡，均符合Hardy-Weinberg平衡，研究样本具有群体代表性。

2.2 各组基因型和等位基因频率比较 对各组基因型频率及等位基因频率进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组基因型和等位基因频率比较[n(%)]

3 讨论

TS是一类临床症状复杂的神经精神发育性障碍，主要表现为运动和发声抽动，同时可伴有其他儿童情绪行为障碍，如ADHD、OCD、焦虑、抑郁、学习障碍、自伤及伤人，甚至出现类精神分裂症样症状。目前关于TS共患病及症状研究分歧明显，有观点认为这些症状为TS疾病症状谱的一部分，另外一些观点认为是两种或多种疾病共患[7]。已有研究显示，TS病因复杂，确切病因不详。已有的影像学和解剖学研究认为基底节相关环路异常与多巴胺系统功能异常参与了疾病的发生发展，因此根据其临床特征进行细致的临床分型，对于不同病因学的寻找可能是有利的。

Comings DE等[5]研究显示TS与DRD3受体基因存在关联；而随后Brett P等[8]及Hebebrand J等[9]的研究没有发现TS与DRD3受体基因存在关联。Devor EJ等[10]对16个TS家系进行研究，结果显示DRD3受体基因多态性位点Bal I与 Msp I存在连锁不平衡，但与TS不存在关联。Diaz-Anzaldua A等[11]对110个核心家系进行TDT分析研究发现TS与DRD3不存在关联。Kowalska A等[12]对TS遗传易感进行综述，发现DRD3基因关联研究未得到较好的重复。

本研究团队2015年曾进行病例对照研究显示DRD3基因SNP位点rs6280基因型及等位基因频率差异无统计学意义；家系研究TDT结果显示DRD3基因SNP位点rs6280等位基因无传递不平衡现象[14]。导致研究结果不一致的原因可能与TS本身异质性较大有关，故在既往研究的基础上，本研究根据TS共患病情况，对TS进行深入的临床分型，寻找不同亚型可能的遗传学病因。通过本次临床分型后的进一步分析显示，DRD3基因SNP位点rs6280在TS不同亚型患者及正常对照人群中频率差异均无统计学意义，这提示DRD3基因SNP位点rs6280与TS及其亚型可能不存在关联。

本研究存在的主要问题是经过具体的临床分型，各型的样本量较小，可能导致研究结果出现偏移。另外，主要根据主要的两个共患病ADHD、OCD进行临床分型，出于样本量的考虑，没有纳入如情绪障碍、学习障碍等其他共患病进行探讨；本研究仅对DRD3基因的1个SNP位点进行了研究，在多基因遗传病中，单个基因的致病作用可能是与其他多个致病基因以及环境之间交互作用的结果。因此，未来研究应继续扩大样本量，探讨更符合疾病特征的临床分型，进行多个微效基因与环境相互作用的研究，以深入探讨不同临床分型的TS的遗传机制。