相关性miRNAs在骨肉瘤中作用的研究进展

1 相关miRNAs在骨肉瘤中的差异性表达

骨肉瘤来源于多能干细胞(间质干细胞)，而非分化异常的成骨细胞。间质干细胞在向骨细胞分化的过程中出现基因遗传学的改变而分化成异常的骨肉瘤细胞[5]。目前的研究已证实，miRNAs在肿瘤细胞内表达存在明显差异性。与正常细胞相比，相关miRNAs表达水平出现增高或降低，同时大量研究结果揭示相关性miRNAs在骨肉瘤组织细胞内表达水平的上升与下降与骨肉瘤发生发展等进程密切相关，miRNAs表达谱的差异性分析为相关性miRNAs在骨肉瘤中作用的阐述提供了依据。

近期1项研究发现，骨肉瘤细胞中染色体14q32区的miR- 369- 3p、miR- 382、miR- 134和miR- 127- 3p表达减少，miR- 17- 5p、17- 3p、18a和19a表达增加[6]。另1项关于miRNA- 145在骨肉瘤中的表达情况的实验中，通过RT-qPCR技术检测166例骨肉瘤组织及正常无瘤骨组织中miR- 145的表达水平，结果显示，与正常无瘤骨组织相比，miR- 145在骨肉瘤组织中的表达明显下调。166组标本根据miR- 145表达水平的高低分为两组，统计学分析表示，miR- 145相对高表达的患者多处于临床早期，肿瘤无明显远处转移，且对化疗敏感，总体生存期更长；而miR- 145低表达的患者多处于临床晚期，肿瘤多伴有明显远处转移，同时对化疗效果差，总体生存期更短[7]。这是第一次有明确证据证明miR- 145的低表达与骨肉瘤的转移及化疗抵抗相关，miR- 145有望成为判断骨肉瘤预后的独立标志物及靶向治疗的靶点。在1项关于3AB-OS骨肉瘤细胞株中189种miRNAs的表达情况的实验中，发现152种miRNAs表达水平与正常细胞相比出现明显差异，其中46个具有明显差异的miRNAs及其受其调控的靶基因与细胞增殖、分化和凋亡，以及Wnt和MAPK等信号通路密切相关[8]。

2 miRNAs与骨肉瘤的发生发展

miRNAs已经成为目前骨肉瘤分子生物学研究的热点及重点。miRNAs在骨肉瘤中作用的研究才刚刚起步，一些miRNAs在骨肉瘤发生发展中的一些调节机制及相应靶点已被发现。部分miRNAs促进了肿瘤的发生发展，而部分则起抑制作用。这些miRNAs的发现及机制的研究为骨肉瘤的研究开辟了新的邻域。

2.1 促进骨肉瘤发生发展的相关miRNAs

在骨肉瘤细胞组织中，起致癌作用的miRNAs通常表达上调，其靶向抑制抑癌基因的表达而促进肿瘤的发生发展。近期1项实验研究中，miR- 21被转染至U2OS和MG- 63两种骨肉瘤细胞系中，发现骨肉瘤细胞系细胞增殖能力较未转染的对照组明显增强；同时转染反义miRNA- 21的细胞其细胞增殖能力受到显著抑制。人骨肉瘤细胞增殖过程中miRNA- 21是通过抑制反转录富含半胱氨酸(RECK)蛋白的表达,进而介导骨肉瘤细胞的表型转换。miR- 21的异常高表达抑制了RECK的抑癌作用，而促进了癌细胞的增殖[9]。另1项关于miRNA- 421在骨肉瘤中作用研究发现，miRNA- 421在骨肉瘤中的表达明显高于癌旁正常组织；过度高表达的miRNA- 421通过抑制抑癌基因MAP2K4起促进MG- 63细胞增殖、迁移、侵袭的作用；同时临床研究也表明与低表达的患者相比，血清中高表达的骨肉患者总体生存期更短[10]。

2.2 抑制骨肉瘤发生发展的相关miRNAs

在骨肉瘤细胞内，起抑癌作用的miRNAs通常表达下调，而其抑癌作用的机制研究为骨肉瘤基因治疗提供潜在的靶点。1项研究发现，与瘤旁组织相比，原发性骨肉瘤组织中，miRNA- 143呈现明显低表达；而将miRNA- 143转染至MG- 63细胞株后，发现miRNA- 143后诱导细胞G1期阻滞，促进细胞凋亡[11]。在此基础上，近期的1项分子生物学实验发现，miRNA- 143的表达与抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤- 2蛋白(BCL- 2)的表达呈负相关；miRNA- 143直接靶向作用于BCL- 2蛋白，抑制其抗凋亡作用而发挥促凋亡作用[12]。miRNA- 143与BCL- 2之间的相互作用机制为骨肉瘤基因治疗提供了潜在靶点。另1项关于miRNA- 130a在骨肉瘤中作用的研究发现，miRNA- 643在骨肉瘤组织及细胞中表达下调，而转染miRNA- 130a的细胞增殖、侵袭能力显著降低；miRNA- 643的直接作用靶点为癌基因ZEB1，抑制ZEB1能起到与miRNA- 130a相同的作用[13]。由此可见，miRNA- 130a靶向作用ZEB1而起抑癌基因的作用，miRNA- 643与ZEB1之间复杂的作用关系可成为骨肉瘤的潜在治疗靶点。

总之，大量的miRNAs研究已证实，部分miRNAs促进了骨肉瘤的发生发展；同时一部分miRNAs则起抑制作用[6，14]。但是，目前miRNAs对骨肉瘤的调控的具体机制研究才刚刚起步，促癌基因与抑癌基因之间相互的作用关系，以及促/抑癌基因与其相对应的靶基因之间相互作用的机制构成的复杂调控网络仍待进一步发掘与研究。

3 miRNAs与骨肉瘤的转移

骨肉瘤早期就会出现远处转移，且以肺转移为主，病情恶化迅速，病死率较高。确诊骨肉瘤时，约有半数的患者已出现不同程度的肺转移。单纯的手术治疗无法避免骨肉瘤的远处转移，而且骨肉瘤一旦发生肺转移，其5年生存率在20%～ 25%[16]。而近年来的研究指出，大量的miRNAs与肿瘤细胞转移相关的细胞运动、胞间黏附、细胞与基质之间的相互作用密切相关[17]。因此，研究与骨肉瘤远处转移相关，特别是与肺转移相关的miRNAs以及其相对应的靶基因并调控机制，对控制骨肉瘤远处转移特别是肺转移的靶向治疗以及改善患者术后，提高患者生存率具有重大意义。

肺转移是血道转移最常见的部位之一。骨肉瘤瘤体周围丰富的血供及供养血管的形成是早期血道转移发生的先决条件。而肿瘤细胞促进新毛细血管的生成与其分泌的肿瘤血管生长因子(VEGFA)密切相关。最近一项研究发现，骨肉瘤组织中miRNA- 1表达下调，并与VEGFA表达呈负相关，通过双荧光素酶报告基因检测显示VEGFA是miRNA- 1的直接作用靶点；当siRNA敲除miRNA- 1后VEGFA表达上调并抑制U2OS细胞的迁移与体外迁移[18]。

Wnt通路机制在肿瘤细胞侵袭转移中具有重要作用。本课题组经过体外细胞株实验发现，使用Wnt通路阻滞剂(icrt- 14及XAV- 939)阻断Wnt通路时，骨肉瘤MG- 63及U2OS细胞株增殖及迁移侵袭出现明显的抑制，表明Wnt/β-catenin通路与骨肉瘤转移密切相关。近期1项关于miRNA- 214的实验研究发现，被转染miRNA- 214的MG- 63及U2OS细胞株内Wnt通路的下游蛋白β-catenin表达异常上升，同时细胞迁移及体外侵袭能力均强于对照组[19]。由此可见miRNA- 214通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进骨肉瘤细胞的侵袭转移。而近期另1项研究发现，miRNA- 107在骨肉瘤组织中低表达，而DKK- 1表达上调；miRNA- 107通过调节Wnt/β-catenin通路下调DKK- 1的表达起抑制骨肉瘤细胞的增殖转移[20]。上述两项研究表明，miRNAs与骨肉瘤转移机制相关信号通路的异常激活密切相关，这为靶向治疗骨肉瘤转移，提高患者生存率提供了靶点。

目前关于骨肉瘤细胞转移侵袭相关的miRNAs研究才刚刚起步，促进转移与抑制转移的相关性miRNAs间相互作用的关系机制仍不十分清楚。大量与骨肉瘤细胞转移相关的miRNAs正不断被人们发现与研究，这为控制骨肉瘤细胞远处转移，提高患者生存率提供了新的靶点发方向。

4 外周血中miRNAs与骨肉瘤

4.1 外周血中miRNAs的表达与检测方法

通过手术切除的肿瘤标本进行分子生物学检查存在明显局限性，因而患者外周血中核酸分子(CNA)的检测成为了研究的热点。大量研究发现，miRNAs不仅只存在于组织细胞内，在包括血清、血浆、唾液、尿液、精液及乳汁等各种体液或分泌物中都有发现[21]。而且外周血中的miRNAs在反复冻存-解冻，煮沸，过酸(pH=2)和过碱(pH=13)等条件下，均能保持浓度和生物活性稳定[22]，这为外周血中miRNAs替代组织标本成为新型检测指标提供了依据。

目前miRNAs的检测方法有：Northern印记杂交、RT-qPCR、基因芯片等技术，其中RT-qPCR应用最广泛。PT-qPCR技术是指将荧光基因加入PCR反应体系中，利用荧光信号的积累来监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该方法可区别前体miRNAs与成熟miRNAs。血液中miRNAs的检测最常使用该种方法。

4.2 外周血中miRNAs在骨肉瘤中的意义

目前大量研究表明，检测外周血中骨肉瘤相关mRNAs表达水平，为疾病早期诊断及病情进展监测提供了更加方便快捷的手段，具有重要意义。1项关于20例骨肉瘤患者以及20名健康对照者血清中miRNAs的表达谱的研究发现，miR- 106a- 5p、miR- 16- 5p、miR- 30a- 5p、miR- 425- 5p、miR- 45- 1a、miR- 25- 3p和miR- 139- 5p在骨肉瘤患者血清中呈现异常低表达。通过标准曲线分析这7种miRNAs表达有望成为骨肉瘤早期诊断、病情检测的无创性标志物[23]。另1项关于骨肉瘤患者术前、术后及健康对照者血清中miRNA- 199a- 3p的表达水平的研究中，90名骨肉瘤术前患者和50例术后1月及90名健康对照血清中miRNA- 199a- 3p的表达水平显示，骨肉瘤患者血清中miRNA- 199a- 3p的表达明显上升，并且术后一月的患者血清中浓度较术前患者明显下降，提示血清中miRNA- 199a- 3p有望成为骨肉瘤早期诊断与病情监测的新型指标[24]。与正常患者相比，骨肉瘤患者外周血中相关miRNAs组成和浓度的差异性表达为外周血中相关miRNAs成为骨肉瘤早期诊断、预后判断和病情分析的无创性生物标志物提供了依据。

5 小结与展望

miRNAs与骨肉瘤的发生发展、侵袭转移以及预后息息相关，并在其中发挥着重要作用。miRNAs在骨肉瘤组织细胞中的差异性表达为骨肉瘤早期诊断及治疗提供新的作用靶点。通过研究药物影响miRNAs在骨肉瘤细胞中的表达水平，进而影响肿瘤的病情进程与预后，为研究分子靶向类药物治疗骨肉瘤提供了新的方向。近年来，随着大量miRNAs的发现，其生物合成、生物学功能、作用机制与疾病的相关性研究已取得一定的成果，特别是miRNAs在肿瘤疾病中的研究取得了很大的进展。但必须认识到miRNAs与骨肉瘤的研究还面临很多的难题和空白。首先还有大量与骨肉瘤相关的miRNAs和靶基因，以及之间的功能与作用途径未知；其次miRNAs与靶基因之间控制调节和多个miRNAs之间的相互调控以及反馈机制未知；还有miRNAs与骨肉瘤相关的各种信号通路之间作用关系，及多种miRNAs对一种信号通路的协调控制机制，以及反馈机制尚不明确。总之，miRNAs与骨肉瘤之间关系的探索为骨肉瘤临床的早期诊断、分子靶向治疗、预后判定提供了新的思路和挑战。