声动力疗法引起的细胞自噬在肿瘤和动脉粥样硬化中的研究进展

李 贺，田 野,2，田 振*

(1.哈尔滨医科大学 基础医学院 病理生理教研室， 黑龙江 哈尔滨 150081；2.哈尔滨医科大学附属第一医院 心血管内科， 黑龙江 哈尔滨 150001)

声动力疗法(sonodynamic therapy，SDT)是利用超声波对生物组织有较强的穿透能力，无创伤地将声波传播到深部组织，并激活组织吸收的声敏药物(如血卟啉)而产生一系列生物学效应。单独使用血卟啉或超声对小鼠的肿瘤生长无明显抑制作用，然而血卟啉联合超声(即SDT)却具有很好的协同杀伤肿瘤效应[1]。SDT能够诱导体外培养的巨噬细胞发生凋亡，对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块也有显著的疗效[2]。目前，SDT诱导细胞凋亡的能力被普遍认可[3]，然而仅仅通过凋亡机制并不能完全解释SDT的治疗作用。近年来，研究发现SDT还可以通过促进细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成而增加细胞自噬[4]。

细胞自噬是真核细胞中特有的一种高度保守的细胞自身内容物降解过程，通过细胞自噬泡包裹内源性细胞成分 (如氨基酸、 游离脂肪酸和核苷酸等)

并经过溶酶体途径降解，藉此满足细胞本身的代谢需要和完成某些细胞器的更新[5]。研究发现细胞自噬功能紊乱与多种疾病的发生发展密切相关[6- 7]。阐明SDT与细胞自噬的关系将为指导疾病的治疗提供理论依据。

1 细胞自噬

1.1 细胞自噬的作用

在正常生理条件下，细胞自噬具有维持氨基酸池的稳态、抗衰老、抑制肿瘤、清除胞内微生物和调节免疫等重要功能。而在刺激条件下，如生理性应激刺激(如缺氧和内质网应激)、激素刺激、药物(如雷帕霉素)、固有免疫信号和疾病(如微生物感染和心脏病)等，细胞自噬水平要明显高于基础水平。此外，细胞自噬功能在神经退行性疾病、感染疾病和衰老等疾病中也可能会降低。

1.2 细胞自噬的过程

细胞在刺激作用下，小的囊泡形成杯状分离膜(也称吞噬泡)，延长并随后包裹部分细胞质和细胞器，最终形成双层膜结构——自噬小体(autophagosome)。自噬体外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)。被吞噬的物质和自噬溶酶体内膜在水解酶和强酸的环境下变性并被降解为氨基酸、脂肪酸、碳水化合物和核苷酸，随后运送到细胞质供细胞重新利用[8]。超过30种自噬相关基因(autophagy-associated gene，ATG)编码的蛋白参与了吞噬泡延伸、自噬体与溶酶体的融合过程[9- 10]。细胞自噬是一个比较复杂的动态过程，因此仅仅检测微管相关蛋白(LC3-Ⅱ)和beclin- 1等蛋白的改变并不能完全说明细胞自噬的真实变化。目前,还没有一种特别简洁有效的方法能够直观的反应细胞自噬的变化，所以需要透射电镜、免疫印迹和荧光标记等多种检测手段同时使用，增加结论的可靠性。

2 SDT诱导细胞自噬的机制

SDT是在光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)理论与技术的基础上演变而来的，在肿瘤和动脉粥样硬化疾病的治疗研究中取得了良好的效果[11]。目前，研究认为ROS的产生可能是SDT发挥作用的基本机制。ROS对细胞具有广泛的作用，例如，ROS能引起细胞凋亡，也能引起细胞自噬。

2.1 SDT通过产生ROS引起细胞自噬

SDT的影响因素较多，主要包括声敏剂种类、超声参数、细胞类型和实验条件(如氧气浓度等)等。由于这些不确定因素和研究手段的限制，对SDT的机制的研究面临巨大挑战。目前比较公认的SDT机制之一是超声空化作用。超声波产生的小气泡(空化泡)会随着周围的液体的振动而不断运动、膨胀甚至溃灭。空化泡溃灭时会导致大量ROS的产生。声敏剂在这一过程中起到载体的作用[12]。

SDT可以短时间内产生ROS，ROS瞬时就会被分解，然而部分文献中的ROS高峰却是在SDT结束后1～2 h[13]。SDT时，细胞内ROS的增多可能与多种因素有关，例如SDT直接可产生ROS，同时细胞内线粒体也可以产生ROS，另外细胞的抗氧化能力也可能下降。因此，SDT所引起的ROS升高有可能是SDT直接产生的，也可能是细胞功能与代谢状态改变而间接产生的。SDT促进ROS升高的确切机制仍需要更多的后续研究进行阐明。

在SDT前使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理培养的巨噬细胞，SDT引起的细胞自噬被显著抑制[13]。该结果说明SDT可以引发细胞自噬，而产生的ROS可能是引起细胞自噬的重要因素。

2.2 SDT引起细胞自噬的信号通路

SDT提高细胞内ROS的含量，通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路激活细胞自噬。SDT可以显著提升细胞LC3-Ⅱ和beclin- 1的蛋白表达水平，降低p-AKT、p-mTOR和P62蛋白表达水平，在透射电镜下可以清晰的观察到自噬体的独立双层膜结构。分别使用PI3K抑制剂、AKT抑制剂和mTOR抑制剂预处理巨噬细胞, 明显降低细胞p-AKT、p-mTOR和P62的表达水平，升高LC3-II和beclin- 1的表达[14]。此外，腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)通路也部分参与了SDT诱导细胞自噬的过程。使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1)等自噬抑制剂, 阻断自噬流，SDT引起的降低炎性反应和促进脂质代谢的作用消失[13]，说明细胞自噬在SDT治疗动脉粥样硬化疾病中可能发挥重要作用。

3 SDT引起的细胞自噬对疾病的影响

细胞自噬在不同的疾病中可能发挥不同的作用，其具体作用与疾病的发病机制有密切关系。例如，细胞自噬增高可能会有利于肿瘤细胞的生存[4, 15]，但却具有抗动脉粥样硬化进展的作用[16- 17]。

3.1 细胞自噬与肿瘤

SDT最早的应用于治疗肿瘤，可以特异性的造成癌细胞凋亡和坏死，但同时也会引起细胞自噬的发生[4, 18]。

细胞自噬最初被认为是一种促存活机制，在不利的环境下促进细胞存活，但最近的研究表明诱导细胞自噬也可以导致细胞死亡，被称为自噬性死亡(Ⅱ型程序性细胞死亡)。自噬既能通过抑制凋亡通路而延缓细胞凋亡[19]，也能作为一种程序性死亡方式导致细胞死亡[20]。因此，探讨SDT诱导的细胞自噬对杀伤肿瘤细胞的影响，可以为提高抗肿瘤效率提供依据。

小鼠淋巴细胞白血病L1210细胞在SDT治疗0.5 h后细胞自噬被活化。使用自噬抑制剂增加SDT诱导L1210细胞凋亡[21]，结果说明了在SDT治疗L1210细胞中，细胞自噬的作用不是诱发自噬性死亡，而是抑制凋亡的发生。

综上所述， SDT引起的细胞自噬通过对抗SDT的杀伤作用而促进肿瘤细胞的存活，为治疗肿瘤增加难度。因此，未来可尝试使用SDT联合自噬抑制剂，可能会增强抗肿瘤的临床效果。

3.2 细胞自噬与动脉粥样硬化

提高细胞自噬水平对动脉粥样硬化有一定治疗意义[22]。动脉粥样硬化是一种慢性炎性反应疾病，在早期和发展期单核巨噬细胞参与炎性反应并分泌各种炎性反应因子。炎性反应活化能导致蛋白酶分泌、组织破坏和斑块破裂。使用SDT可以明显减少巨噬细胞白介素- 1β(IL- 1β), 白介素- 12(IL- 12)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达和分泌。单纯超声和单纯声敏剂对细胞无明显影响。使用自噬抑制剂和ROS清除剂可逆转这种改变[14]。细胞自噬能降低巨噬细胞的炎性反应，然而是否有炎症体自噬降解途径的参与目前还不甚清楚。

随着动脉粥样硬化的进展，巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，其细胞自噬功能损伤，导致斑块内脂质负载和脂质无法降解[23]。SDT促进转录因子TFEB核转位使溶酶体再生，提高细胞自噬，从而抑制脂质摄取，增加脂质流出。TFEB是一种重要的转录因子参与细胞内调控多种脂质降解相关基因的表达。SDT后腺苷三磷酸结合盒转运体A1(ABCA1)表达水平升高，增加了脂质流出；跨膜的白细胞分化抗原36(CD36)和清道夫受体A(SR-A)表达降低，抑制脂质摄取，从而达到疾病治疗的效果[13]。

4 SDT诱导细胞自噬的优势

SDT诱导细胞自噬具有常规药物与PDT不可比拟的优势，该疗法具有靶向性强、穿透性深、精准和副作用小等特点。

4.1 靶向性强

借助声敏剂的组织特异性吸收及超声波的聚焦控制可实现较高的靶向性。例如，肿瘤具有高代谢特点，可以比正常组织吸收更多的声敏剂。同时借助超声治疗仪可以将超声的能量聚集在局部区域。因此，声敏剂和超声的双重特异性使得SDT调控细胞自噬具有很强的靶向性。

4.2 穿透性深

PDT穿透深度有限，无法到达人体深部组织，这决定了PDT只能治疗表浅的病灶，如皮肤病和乳腺癌等。SDT所使用的超声是机械波，波长较长，在人体组织传播时，传播能量损失小，所以传播距离大，穿透能力强，可用于心血管疾病或体内较深的肿瘤的治疗。

4.3 精准性高

根据疾病的特点，精确调节自噬的程度有助于疾病的治疗和康复。随着医学不断的发展和科技水平的提升，对疾病的治疗不再是一概而论，而是在治疗方案中渐渐重视个体之间的差异，即精准医学。而利用超声仪器可以根据不同个体的组织声敏剂浓度、氧浓度和声场分布等特性而调节治疗的时间、超声的强度和频率等参数，符合精准医疗的理念。

4.4 其他优势

当前，肿瘤治疗的常规的方法是手术治疗，不但费用昂贵和操作复杂，而且安全性低，预后较差。SDT是一种无创的治疗方法，对人体的损伤程度很轻，并且可以对手术不耐受的患者进行治疗。

5 问题与展望

SDT作为一种新兴的治疗技术，其引起的自噬对肿瘤和动脉粥样硬化等疾病的治疗具有重要影响。SDT对细胞自噬的调控具有靶向性强和穿透性深等优势。然而，已有的研究仍存在许多不足之处。首先，目前的结果都是基于体外研究，未来可以更多的采用在体研究，探究SDT对机体的作用；其次，研究内容单一，未来可应用分子生物学，组学和生物信息学深入挖掘SDT调控自噬的机制以及细胞自噬的作用。总之，SDT的作用和具体机制仍需进一步研究。相信不久的将来，SDT可以作为一种新的治疗手段，为临床服务。